ラベル - 長春クリアフロンティアテクノロジーズグループ株式会社

Scientific Reports volume 13、記事番号: 3625 (2023) この記事を引用

580 アクセス

1 オルトメトリック

メトリクスの詳細

バイオチップベースの研究は現在、生体内微小環境と同様の三次元的かつ大規模な基盤へと進化しています。これらの標本を長期間ライブで高解像度イメージングするには、ラベルフリーでマルチスケールイメージングが可能な非線形顕微鏡の重要性がますます高まっています。非破壊コントラストイメージングと組み合わせると、大きな標本内の関心領域 (ROI) を効果的に特定し、結果として光損傷を最小限に抑えることができます。この研究では、ラベルフリー光熱光学コヒーレンス顕微鏡法 (OCM) が、多光子顕微鏡法 (MPM) で調査中の生体サンプル内で目的の ROI を特定するための新しいアプローチとして機能します。出力を下げたMPMレーザーによるサンプル内の弱い光熱摂動は、高感度の位相微分光熱（PD-PT）OCMを使用してROI内の内因性光熱粒子で検出されました。 PD-PT OCM の光熱応答信号の時間的変化をモニタリングすることにより、MPM レーザーによって集光されたサンプル内に生成されたホットスポットが ROI 上に位置しました。 x-y 軸での自動サンプル移動と組み合わせることで、MPM の焦点面を体積サンプルの目的の部分に効果的にナビゲートして、高解像度のターゲット MPM イメージングを実現できます。我々は、2つのファントムサンプルと、幅4 mm、長さ4 mm、厚さ1 mmの寸法の顕微鏡スライド上に固定された昆虫である生物学的サンプルを使用して、第二高調波発生顕微鏡における提案された方法の実現可能性を実証しました。

多光子顕微鏡 (MPM) により、さまざまな生物学研究分野での高解像度分析が可能になります。近年、MPM の使用は生物医学イメージング、特に小動物の生体内および生きた深部ニューロンイメージング 1,2,3,4,5、腫瘍の早期検出とその特性評価 6,7 の分野で注目を集め続けています。 8,9、バイオチップにおける微小環境における血管網とオルガノイドイメージング10,11,12。他の同様の変更に加えて、適切な蛍光色素13、補償光学14、マルチビームおよび多焦点機構15、16を採用することにより、イメージング深度を増やし、視野（FOV）を拡大し、体積測定スキャン時間を短縮するための多くのアプローチが存在しています。光学セットアップでは、イメージングのニーズやアプリケーションシナリオに応じて採用可能な MPM イメージングシステムのバリエーションが提供されています 5、16、17、18、19、20、21。

光損傷と光退色は、多光子イメージングにおいて考慮すべき重要な要素です。ラベルフリーの多光子イメージングに必要な高いレーザー出力を伴う長時間の照射では、組織損傷の光メカニズムが発生し、蛍光が増強されて細胞死を引き起こします。これは光損傷と広く呼ばれています 22、23、24。生細胞での光損傷の発生を回避するには、ピーク強度、繰り返し速度、長時間露光（滞留）時間などのイメージングパラメータが光損傷閾値を十分に下回るように注意する必要があります24。これらのパラメータのほとんどは、ソースおよび検出システムによって制御できます。複数の研究グループが、光退色と光損傷の影響を抑制するためのさまざまなアプローチを研究し、提案しました。最も単純で最も広く採用されている方法は、光源の総照明パワーを減らすことです4、25、26。ただし、これにより、信号対雑音比が低下するため、システム全体の感度が低下します。この影響を軽減するために報告されている代替アプローチには、サンプルに照射される光を空間的に制御する制御照射法、照射レーザーパルスを等しいエネルギーのサブパルスに再分配するパッシブパルススプリッターの使用、および高速光走査が含まれます。照明と標本からの発光の収集を制御することで光損傷を軽減するメカニズム27、28、29、30。さらに、ライトシート照明法を使用すると、検出対物レンズの焦点面のみが効果的に照明されます31。これらの方法は光損傷や光退色効果を軽減するのに役立ちますが、FOV が小さく、体積スキャン時間が長く、大きなサンプルで関心領域 (ROI) を検索する場合は、長期間の高出力照明が必要となるため、光損傷や光退色が発生します。

ここ数十年で、複数の研究グループが、MPM と光コヒーレンス断層撮影 (OCT) の両方を単一のマルチモーダルイメージングプラットフォームとして組み込むことの利点を報告しました。この利点は、互いのモダリティの制限を補います 32、33、34、35。特に、MPM および OCT イメージング技術は、解像度、FOV、イメージング深度、およびイメージング速度の点で異なる特性を持っています。たとえば、MPM は非線形メカニズムを使用しており、横方向および軸方向の分解能は高くても FOV が小さい、高開口数 (NA) 対物レンズを備えたサンプル内でレーザービームをしっかりと集束させる必要があります。さらに、OCT は、アプリケーションに適した解像度と FOV をより柔軟に選択できるリニアイメージングシステムです。イメージング深度に関しては、MPM は通常、高散乱や収差が存在する生体サンプルで数百マイクロメートルのイメージング深度を提供しますが、OCT は近赤外光源のより高い透過力を利用して、生体サンプルで 1 ～ 2 mm のイメージング深度を達成します。。 MPM システムを使用してサンプルの体積画像を生成するには、サンプルを軸方向に移動するために横方向の 2 次元走査を備えた Z 軸ステージを使用する必要があります。対照的に、OCT は、サンプルを軸方向に移動することなく、ラスター X-Y スキャンのみを使用して体積画像を取得できます。 MPM-OCT を組み合わせたシステムは、イメージングにおける各システムの優位性を相補的に利用することで、生物学的研究のための効果的なマルチスケールイメージングプラットフォームとして機能します。

OCT の導入以来、さまざまな研究グループが、イメージング要件に関する新しい方法を確立するために、レーザー光源と検出メカニズムのさまざまな機能特性を調査および利用してきました。いくつかの例には、サンプル内の流れ測定のためのドップラー OCT 36、サンプル内の複屈折特性を研究するための偏光感受性 OCT 37,38、サンプル内の構造の応力と引張強度を測定するための光コヒーレンスエラストグラフィー 37,38、波長依存性を調査するための分光 OCT が含まれます。サンプル内の構造の光の吸収と散乱37、38、およびサンプル内の熱変動を分析するための光熱OCT（PT-OCT）39、40、41。これらの技術の中でも、PT-OCT は、サンプルの熱変動とその結果として生じる物理的および光学的特性の変化を評価するため、研究で大きな注目を集めています。 PT-OCT システムでは、ナノ粒子、光熱応答性外因性造影剤、および吸収剤を利用して、サンプル内の光熱効果を生成および測定しています 42、43、44、45。現在まで、外部造影剤の代わりに内因性造影剤を使用する研究は、有用性の欠如と弱い光熱応答信号の測定の難しさにより制限されてきました。ミルナーら。は、外部の造影剤や吸収材料を使用せずに、組織内の光熱応答を深さ分解して検出するための微分位相測定を提案しました。提案された光熱応答検出技術は、コントラストや吸収体を必要とせずにサンプルに適用できますが、複屈折材料によって導入されるサンプル走査における 2 つの異なる干渉経路を一致させるために、複数の専用検出チャネルと高速走査光学遅延が必要です。さらに、妥当な信号対雑音比で光熱応答を測定するために必要な照明レーザー出力は、生体サンプルに対して通常 80 ～ 100 mW です 47。 PT-OCT 技術の最近の進歩により、単一の検出チャネルを使用し、レーザー照射出力を 4 ～ 10 mW に下げて、内因性コントラストを使用した効果的な光熱応答測定が可能になりました 39,48,49,50。

この研究は、全体的な光損傷と光退色効果を軽減し、体積サンプルの多光子イメージングにおけるユーザーの利便性を向上させる、サンプルボリューム内の 3 つの軸に沿った新しい ROI 位置メカニズムの方向性の先駆けとして機能します。所望の ROI は、光コヒーレンス顕微鏡 (OCM) の完全に観察可能な深さと横方向の範囲内で選択されました。 MPM レーザー光源によって照射された光熱効果によるサンプルの光学特性の変化は、高感度の位相微分光熱 (PD-PT) OCM を使用して ROI 内の内因性光熱粒子で測定されました。 PD-PT OCM の光熱応答信号の時間変化をモニタリングすることで、励起レーザーの焦点位置 (ホットスポット) を ROI 上に配置しました。 x-y 軸での自動サンプル移動と組み合わせることで、MPM の焦点面を体積サンプルの目的の部分に効果的にナビゲートして、高解像度のターゲット MPM イメージングを実現できます。 ROI ナビゲーションは、低出力 (従来の出力より 10 分の 1 未満) MPM レーザー光源を使用して実現されました。 PD-PT OCM ガイド法は、サンプルの光退色や光損傷を引き起こす高出力レーザー照射を必要とするあらゆる非線形イメージング技術（たとえば、二光子励起蛍光やコヒーレントアンチストークスラマン散乱顕微鏡など）に実装できます。

高エネルギーのレーザー光線がサンプルに照射されると、内部温度とサンプル内部構造の光学的特性が変化します51。ＯＣＴイメージング技術において、フーリエドメインＯＣＴで検出された干渉信号は、式（１）のように表すことができる。 (1) 複雑な形式:

ここで、z は参照ミラーとサンプル内の界面の間の光路長の差です。 \({I}_{R}\) と \({I}_{S}\) は、それぞれ参照ミラーとサンプル界面からの後方反射光の強度です。 \(\Phi \left(z,t\right)\) は干渉信号の位相項であり、特定の時点での空間内の深さに依存する屈折率の積分関数として次のように表すことができます。式で表される。 (2):

ここで、ω は光源の中心角周波数、c は真空中の光の速度です。サンプルは空間領域の正側に位置すると仮定し、\(n\left(z,t\right)\) はサンプル内の深さと時間依存の屈折率を表します。サンプル内で温度変化が発生すると、サンプル内で光学的に観察される熱応答は、熱弾性効果と熱屈折効果による相変化です。したがって、式。 (2) は、式 (2) で表されるように、熱応答を考慮して拡張できます。 (3) (参考文献 47)。

ここで、dn/dT は温度による屈折率の変化を表し、\(\Delta T\left(z,t\right)\) はサンプル組織の温度変化を表し、\(\beta\) は熱膨張を表します。係数47。 MPM レーザー光源で照射されたときの熱応答によるサンプルの位相変化を測定するために、PD-PT OCM を使用して複雑な干渉信号をデジタル化された値として取得しました。取得された位相項は、深さに沿った累積位相です。したがって、式1で表されるように、蓄積された位相を解決するには、最初に微分が必要です46、47、49。 (4)。

ここで、 \(m\) は A スキャンの深度インデックスであり、 \(n\) は時間間隔 \(\Delta t\) での最初から最後の A スキャン信号までの指定された連続増分インデックスを示します。熱応答感度を高めるために、サンプル上の同じ横方向位置に対する A スキャンの総数 N が得られました。これには、\(\left(N-1\right)\) と間隔 \(\Delta t\) の積に等しい T の期間がかかります。 N 個の A スキャンはフレームと呼ばれます。式1で表されるように、連続するAスキャンが差し引かれ、時間の経過に伴う位相変化が測定されます。 (5)。

ここで、 \(\varphi (m,n)\) は、空間インデックス m と時間インデックス n の時間間隔 \(\Delta t\) 内にシステムで生成されるランダム位相ノイズです。この研究では、800 個の差別化された A スキャンを達成するために、一定期間内に 801 個の A スキャンが取得されました。 -π と π の範囲を超える微分位相は、境界 -π と π 付近で発生する可能性のあるエラーを回避するために、-2π でラップされました。 A スキャンの深さの中から対象となる特定の深さ \(d\) が選択され、その深さで 800 個の微分位相値が達成されました。 d は \({m}_{s}\) と \(\Delta z\) の積に対応します。ここで、\({m}_{s}\) は選択された深度インデックス、\(\Delta z\) ) は深さの間隔です。これらの微分位相値を平均して、時間内に発生した実効位相差としてランダムな位相誤差を抑制し、システムの熱応答検出感度を向上させました。位相ノイズは主に、周囲の熱変化とシステム内の機械振動によって発生します。次に、平均微分位相 \({\Delta \Phi }_{avg}(d)\) が式 1 を使用して計算されました。 (6)。

ここで、 \(\Delta ={\Delta }_{t}{\Delta }_{z}\) と \(\Delta \Phi ({m}_{s},n)\) は、次の位相差値を示します。それぞれ \({n}\) 番目の微分された A スキャン信号内の特定の深さ d。このプロセスを必要な回数 \(Fn\) (フレーム番号) だけ順次繰り返しました。ここで、フレームという用語を、通常 OCT イメージングで使用される B スキャンの従来の表記と混同しないでください。 \(Fn\) は、単一点からの累積された 801 個の A スキャンです。ここで「フレーム」という用語は、B スキャンに関連付けて PD-PT-OCM 信号を取得するのにかかる時間の感覚を読者に熟考して関連付けて、PD-PT-OCM の高速測定機能を理解してもらうために使用されています。提案された方法。サンプル内の光熱応答を摂動させ、MPM レーザー源でその結果生じる位相変化を生成するために、機械式シャッターが MPM 照明ビーム経路に組み込まれ、その後、\( Fn\)、必要に応じて。この研究全体を通じて、特に記載がない限り \(Fn\) に使用された最大値は 50 でした。 50 フレームの測定は摂動に対する光熱応答の読み取りと呼ばれ、照明サイクルに対応します。シャッターは、各照明サイクルの中央付近で開閉するように設定されました。これは、サンプルが自然温度まで冷却するのに十分な時間を確保するためでした。光熱応答の 1 回の読み取りに対するシャッターアクションの実装と、時間の経過に伴う典型的な位相変化を図 1 に示します。

照明サイクル中のフレーム番号、シャッター動作、光熱応答の関係。

脂質、水、メラニン、ヘモグロビンなどの光内因性吸収物質は生体組織に広く存在します52。体積 OCM 画像内の ROI を選択した後、適切な光熱応答を示す ROI 内の吸収剤が光熱応答の観察点として選択されました。 MPM の励起光の焦点位置が観測点に近いほど、光熱応答は大きくなります。観察点と照明ビームの焦点位置との間の距離を変化させながら複数の光熱応答を測定し、光熱応答が最大になる点を決定しました。なお、MPM励起光の焦点面はROI上に配置されており、ROIを探すために歩き回ることなく即座にMPM画像を取得することができた。前述の全体的なワークフローの概略図を図 2 に示します。X-Y 軸での自動サンプル移動と組み合わせることで、ROI の深さ位置特定の検索が拡張され、3 次元で調査できるようになりました。

ラベルフリー PD-PT OCM を使用した光熱反応検出のワークフロー。 PD-PT OCM を使用して光熱信号を計算するプロセスを段階的に図で説明します。

提案された PD-PT OCM 誘導 MPM を実証し、特徴付けるために、この実験研究では 2 つの異なるファントムサンプルが製造および使用されました。 1 つ目は、コンセプトを評価し、検出された光熱信号を分析するために使用される単純なファントムサンプルでした。多層構造を備えた追加のファントムサンプルを使用して、組織構造の血管網などの複雑なサンプルに対する提案されたシステムの適用性の堅牢性を検証しました。最後に、顕微鏡スライドに埋め込まれた 4 × 4 × 1 mm の寸法の昆虫 (Ixodes dammini) サンプルにそれを適用し、生物学的サンプルに対するシステムの実際的な適用可能性を評価しました。使用したサンプルの詳細情報は「材料と方法」セクションに記載されています。

提案された方法を使用して光熱応答を特徴付け、分析するために、単純なファントムサンプル (超音波ゲル) が使用されました。実験プロトコルは、この研究で行われたすべての実験で同様でした（単純および複雑なネットワークファントムサンプルの作製と実験プロトコルについては、「材料と方法」セクションを参照）。光熱応答は図 3 に示すように測定されました。光熱応答の観察点として、ゲル媒体の中央領域に位置する気泡や塵などの後方散乱粒子が OCM 断面画像内で選択されました。図3aに示すように、MPM対物レンズの焦点位置は、カバーガラスの下からファントムサンプルの超音波ゲル領域を横切ってOCMの光軸に沿って上に移動されました。光熱応答は、MPM 対物レンズの 10 µm の移動ごとに、50 回の読み取りに対応する総移動距離の 500 µm まで測定されました。 51 回の読み取りに必要な合計時間は約 73 秒でした。手動翻訳の移動に費やした時間は含まれていません。図3bに示すように、合計読み取り値から100μm間隔の光熱応答信号は、点線の長方形のボックス領域で示されます。各読み取り値で検出された最大光熱応答は、MPM 対物レンズの焦点位置がサンプルの中央領域に近づくにつれて、またそこから離れるにつれて、それぞれ安定した増加と減少を示したことがわかります。予想通り、光熱応答はゲルの中央領域を通過したときに最大になりました。図3c、dは、図3bに示す拡大グラフで、MPM対物レンズの焦点がゲル領域の中央付近にあったときに観察された光熱応答信号と光熱応答の詳細な特性をそれぞれ示しています。図３ｂ〜図３ｄを通して分かるように、すべての読み取り値で検出された光熱応答は、最大温度摂動に対応する位相差変化を表す２つのピークを示した。試料内の温度変化が最も速かったのは、シャッターの開閉直後でした。シャッターが開いているとき、MPMレーザービームはサンプルに焦点を合わせ、図に示すように、サンプルの内部温度の変化による光熱効果を誘発します。これは、最初の温度摂動（温度上昇）領域と考えられます。 3c. 温度が最高値に達して安定すると、位相差の変化は照明がない場合の基準温度の変化に近い値に戻りました。シャッターが閉じると、サンプル内に蓄積された熱エネルギーが減少し始めました。言い換えれば、温度上昇の原因（MPM レーザービーム）がサンプルにさらされなくなると、サンプル全体の温度が低下し、最初の自然温度に落ち着きます。これは、図3dに示すように、第2の温度摂動領域（温度低下）として見ることができます。

単純なファントムサンプルを使用した PD-PT OCM 信号解析。 (a) は、さまざまな深度にわたる MPM 焦点位置の移動を図的に説明したものです。 (b) は、500 μm の深さ範囲内の単純なファントムサンプルで観察された完全な光熱応答です。 (c) は、サンプルの中央領域で観察された光熱応答の拡大グラフです。 (d) は、サンプル内で観察できるピーク光熱応答です。 (e) は、サンプル内の 500 μm の深さ範囲に対してプロットされた最大平均位相値です。 (f) は、(b) の連続する値間の絶対差からプロットされたグラフです。図 (a) は縮尺どおりに描かれていません。

対物レンズの焦点位置の変化に応じた光熱応答の量をさらに分析するために、図3eに示すように、MPM対物レンズのさまざまな焦点位置に対して光熱信号の最大値が深度でプロットされます。これにより、サンプルの全体的な熱応答を視覚化できます。図3eの赤い破線は、MPM対物レンズがサンプル深さ全体に渡って移動されたことを考慮して、光熱応答についてOCMの選択された観察点を示しています。 3 つの強度ピーク (黒色) は、それぞれカバースリップの第 1 表面、カバースリップの第 2 表面、およびスライドガラスの第 1 表面に対応する検出された SHG シグナルです。光熱応答の観察点は、カバースリップの第 2 表面とスライドガラスの第 1 表面を表す 2 つの SHG シグナル間のゲル領域の中央と一致します。光熱信号曲線に 5 次多項式フィッティング (誘導されたランダム位相ノイズを補償するため) を適用することにより、曲線の滑らかな遷移傾向が得られました。さらに、多項式フィッティング後の連続する値間の絶対差を表すプロットを図3fに示します。これにより、MPM 対物レンズの焦点が固定された観測点と一致した瞬間を明確に視覚化することができます。

PD-PT OCM を使用した非線形イメージングの ROI 選択を評価するために、血管や神経ネットワークの組織構造を模倣した大面積多層複合ファントムサンプルが実験で使用されました。サンプルには、蒸留水に浸した厚さ約 300 µm の多層レンズクリーニングティッシュが含まれていました (詳細については、「材料と方法」セクションを参照)。これは、MPM の限られた FOV よりも広い FOV を持つ OCM のリアルタイムの断面および正面イメージング機能を使用して、ROI 選択方法の有効性を検証するために利用されます。これを図 4a ～ c、e、f に示します。図 4a は、水平軸、垂直軸、深さ軸に沿った FOV が 3.0 × 3.5 × 0.3 mm のサンプルの体積三次元 (3D) OCM 画像を示しています。 3D ボリュームイメージは、MPM イメージングの目的の位置にある 2 つの長方形の ROI 領域、つまり最初の ROI (オレンジ色) と移動した ROI (青色) によって強調表示されます。図 4b、e は、ROI 領域で取得された 1.0 × 1.5 mm の FOV の正面 OCM 画像を示しています。図4c、fは、それぞれ図4b、eの青と黄色の長方形のボックス領域内に示されているROIの拡大画像を示しており、SHG画像との比較に使用されました。初期 ROI 内の最初の観察点は、カバースリップに近い深さ 100 μm で選択されました。 MPM 対物レンズの焦点面は、ROI 選択メカニズムを使用して配置されました。図4e〜gは、サンプルをXとYの横方向にそれぞれ1000μm、スライドガラス(Z軸)に向かって深さ方向に100μm移動した後に得られました。さまざまな ROI のナビゲーションをシミュレートします (詳細については、「材料と方法」セクションを参照してください)。サンプルを移動する前、MPM イメージング用に選択された組織構造の領域はカバースリップの近くにありました。サンプルの移動後、画像化される組織構造の領域がスライドガラスの最初の表面の近くに再配置されました。図4d、gは、サンプルステージの移動の前後に取得されたMPM SHG画像を示しています。 SHG 画像は、OCM 体積画像に表示されているオレンジ色と青色の長方形のボックス内の深さ範囲 70 μm のスタック画像であり、これは、MPM 正面画像と OCM 正面画像をよりよく一致させ、相関させるために行われます。示されている赤、オレンジ、青の領域内の白抜きの十字は、それぞれの OCM および MPM 正面画像内の一致する位置に相関しています。

複雑なネットワークファントムサンプルを使用した PD-PT OCM ガイド付き MPM の堅牢性の評価。 (a) はサンプルの 3D 体積 OCM 画像です。 (b、c、e、f) は、複雑なネットワークファントムサンプルの OCM 正面画像です。 (c, f) は、それぞれ (b) と (e) の破線の四角で示された領域を拡大したものです。 (d、g) は、(c) と (f) でスキャンされた同じ場所の重ねられた SHG 正面画像です。さらに、(a) では、オレンジと青の長方形のボックスは、それぞれ最初の ROI と移動した目的の位置の SHG 画像のスタッキング深度範囲を示します。

MPM イメージング用の大量の生物学的サンプルにおける ROI への PD-PT OCM ガイダンスの有用性を検証するために、顕微鏡スライドに埋め込まれた生物学的標本 (メスのマダニ) が使用されました。光熱イメージングの前に、標本は OCM の最大 FOV でイメージングされ、ボリュームレンダリングソフトウェアを使用して後処理されました。ボリュームレンダリングされた OCM 3D 画像を図 5a に示し、深さ 65 μm でのボリューム画像の正面画像を図 5b に示します。リアルタイムの断面および正面 OCM 画像を使用し、PD-PT OCM による光熱応答測定に基づく ROI 選択メカニズムを使用して、生物学的標本の複数の異なるセクションをターゲットにしました。 ROI の選択には、合計領域 4 × 4 mm (垂直 × 水平) が使用されます。特に、脊椎/盾の最上面、左掌の上端、口蓋口の先端、および右掌の上端に位置する 4 つの領域が選択され、標的とされました。これらの部分のうち、口口、触手の左右の端が、マダニのこれらの部分がライム病に関連するマダニの摂食生息地の研究においてより有用であるため選択され 53、また、皮は背面の上部を覆っています。標本の体のほぼすべての部分で、良好に観察可能な PD-PT-OCM シグナルが得られました。また、厚さが厚くなると光熱シグナル応答が減少することは注目に値します。これは、試料の組成と光学的および熱的特性によるものと考えられます。標的領域のSHG画像をそれぞれ図5c〜fに示します。深さが変化するMPM対物レンズの焦点位置に応じて、口孔領域で観察された光熱応答の合計読み取り値を、図5gにプロットしたグラフに示します。ここで使用される 2 つの深さ位置間のステップ間隔は 20 μm です。口孔下部領域全体をカバーするために、合計 11 個の読み取り値が使用されました。図5hに示す代表的な光熱応答のグラフからわかるように、検出された最大位相微分ピークは反比例しませんでした。これは、標本の生物学的構造の熱弾性膨張に起因すると考えられます。

提案された PD-PT OCM 誘導 MPM の生体サンプルへの適用性の検証。 (a、b) は、それぞれ昆虫サンプルの OCM ボリュームレンダリング画像と正面画像です。図（cからf）は、PD-PT OCMガイダンスを使用して取得されたサンプル内のさまざまな領域のMPM正面画像です。（ g ）は、サンプルの口孔領域内のMPM対物レンズの深さ位置を変化させることによって観察された代表的な光熱応答、および（ h ）は、1つのPD – PT OCM光熱応答信号の代表的なグラフです。

MPM の使用は、さまざまな生物医学イメージングシナリオで徐々に普及してきました。 MPM の適用範囲が広がった牽引力の 1 つは、バイオチップに基づく研究調査です。バイオチップベースの研究は現在、生体内微小環境と同様に、二次元 (2D) プラットフォームから 3D プラットフォームに進化しています。特に、将来の薬剤スクリーニングや最終的な臓器置換のために人工臓器を作成するには、大規模な生物学的複雑性を確立する必要があります。これを達成するために、現在、3D プリンティングとオルガノイドベースの自己組織化手法に関する研究が行われています 54,55。長期のライブイメージングや大規模標本のマルチスケール分析では、深部組織イメージングやラベルフリーイメージングが可能な非線形顕微鏡の重要性がますます高まっています56,57。非線形顕微鏡検査を行う場合は、光損傷を避けるように注意する必要があります。提案された方法は、ラベルフリーの多光子イメージングにおける 3D での ROI の位置にサンプル内の内因性粒子を使用します。提案された方法は、高解像度の 3D 分子イメージングが必要な ROI を正確に特定することで光損傷を最小限に抑えることができます (補足情報)。この概念は、光退色を最小限に抑えるために蛍光顕微鏡で一般的に使用される位相差顕微鏡の概念に似ていますが、これらの従来のガイド機構はサンプルの 2D トポロジカル画像しか提供しません。 OCT は、透明標本のガイドイメージングツールとして使用される位相差顕微鏡と同様に、大規模で不透明で厚い生体組織の 3D ガイドイメージングのモダリティとして使用できます。

今回の研究では、観測点（OCM対物レンズ）に向かって移動するMPM対物レンズの焦点を手動で変更しながら、光熱応答曲線を取得しました。光熱応答曲線は、測定領域内に 1 つの最大値を持つ単峰関数の形式をとります。将来的には、間隔をあけて 50 回試行する線形探索の代わりに、黄金分割探索 58、フィボナッチ探索 59、またはカーブフィッティング探索 60 (対物レンズに組み込まれた自動アキシャルフォーカスモーターを使用) などの確立された効率的な探索手法を組み込むことによって、 10μm; 目的の点は 10 回未満の試行で同じ精度で見つけることができます。さらに、高速検索アルゴリズムを、MPM 対物レンズの焦点面の軸方向走査用の高速電動装置と組み合わせると、検索時間を大幅に短縮できます。この研究では、寸法 4 × 4 mm (垂直 × 水平) の比較的大きな生体サンプル内に位置する ROI を使用し、深さ方向に 20 µm のステップ間隔で合計 11 回の読み取りを使用しました。ステップ間隔と合計読み取り値は、サンプルの組成と厚さに応じて適応的に選択できます。

MPM 対物レンズ誘導の ROI 位置 (深さ) のエラー発生確率は、OCM システムの軸分解能と位相感度に依存します。使用した OCM システムの軸分解能は約 5 µm です。したがって、MPM 対物ガイドの精度は OCM の軸方向分解能と同じです。提案されたマルチモーダルイメージングシステムは、OCM と MPM が同軸上に配置され、サンプルの反対側に配置されるように構成されています。実証された方法は、サンプル内のMPM対物レンズのホットスポットの絶対位置を測定するため、複雑な構造とサンプル界面を持つサンプルが使用された場合でも、PD-PT-OCM検出のパフォーマンスは誤った測定の影響を受けません。 PD-PT-OCM システムの FOV は、サンプルおよびリファレンスアームのセットアップで対物レンズを変更することで、イメージング要件に応じて適応的に変更できます。ただし、FOV と横方向の解像度は反比例の関係にあります。一般に、FOV 目標が広いほど横方向の解像度は低くなり、その逆も同様です。 OCM の深度分解イメージング能力は、サンプルが厚いと低下します。これは、厚い組織では光の透過が制限されるためです。また、複雑な構造が密に詰まった厚いサンプルでは、検出可能な多光子生成信号が組織の深部で減少します。したがって、MPM のホットスポットによって生成された熱も、より深い組織で分解されます。 OCM を使用した ROI 選択のための提案された方法の有用性は、ここで報告されたファントムサンプルの厚さによって制限されるだけではありません。サンプル内の ROI の選択は、OCM の光学深度範囲全体に沿って可能であり、サンプルの組成と OCM システムに使用される光学系にのみ依存します。サンプル内で生成された光熱信号は、PD-PT-OCM の観察可能な深さ範囲全体に沿って効果的に検出できます。光熱信号の散逸と検出効率の低下は、サンプルの厚さ、組成、光学的および熱的特性に依存します51。

従来、光熱OCTイメージングは、内因性物質である血球の光熱効果を利用して血管を撮像したり、生体組織中のポリマーや金ナノロッドなどの外因性光反応性粒子の位置やホットスポットを計測したりするために使用されています。高感度の PD-PT OCM は、OCM 画像の観察可能な範囲内に内因性または外因性の要因が存在する場合にも使用できます。提案された方法を使用すると、外因性物質による光熱療法の励起照明を注意深くターゲットにし、それを所望の位置に局所的に制限することができるため、正常組織の不必要な加熱を回避できます。

要約すると、この論文は、大量のサンプル内の ROI を効果的かつ正確にナビゲートするための非線形顕微鏡検査のガイドツールとして PD-PT OCM を採用することの潜在的な有用性を示す予備レポートとして機能します。 ROI は、正面および断面 OCM 画像の大きな FOV と観察可能な深度範囲を利用して選択されました。 3D の ROI 内でターゲットを絞った MPM イメージングを実現するために、MPM レーザーを弱い出力で集光したサンプル内で発生するホットスポットを、高感度 PD-PT OCM を使用して検出しました。次に、ROI 内の内因性吸収剤から選択した観察点に MPM レーザーの焦点を合わせました。 PD-PT OCM を使用すると、MPM 対物レンズの焦点位置を OCM 断面画像の観察可能な深度範囲内の ROI 上に配置できます。高解像度MPMイメージングを必要とするROIを効果的に見つけてターゲットにすると、特に大きなサンプルの場合、高出力レーザーの全体的な露光時間を短縮でき、光退色や光損傷を大幅に軽減できます。高感度 PD-PT OCM システムは、三次元生体サンプル内で発生する弱い光熱摂動による温度変化もリアルタイムで検出できるため、光熱反応分析に応用できる可能性があります。さらに、提案された PD-PT OCM ベースのガイド法の有用性は、次のような高出力レーザー照射（サンプルの光退色や光損傷を引き起こす可能性がある）を必要とするあらゆる非線形イメージング技術に実装できることに注意してください。 -光子励起蛍光およびコヒーレント反ストークスラマン散乱顕微鏡。これにより、非線形イメージングシステムにおける ROI 位置の取得に必要な全体的な取得時間が短縮されます。

マルチモーダルイメージングシステムの全体構成を図 6 に示します。マルチモーダルイメージングプラットフォームには 2 つの独立した光源がありました。 OCM システムは、840 nm を中心とする最大出力 18 mW の超発光ブロードバンド光源 (SLD-37-HP3、Superlum Diodes Ltd.、Carrigtwohill、アイルランド) によって駆動されました。ソースからの出力は、光サーキュレーター (850-H7-L-15-FA、OF-LINK Communications Co., Ltd.、中国深セン) の入口ポートに直接接続されました。サーキュレータの出力ポートは、ビームサイズ 2.4 mm のダブレットコリメータ (F240APC-850、Thorlabs, Inc.、ニュージャージー州、米国) に接続されました。平行ビームは、二軸検流計走査ミラー (GVSM002-JP、Thorlabs, Inc.、ニュージャージー州、米国) を使用して、水平軸と垂直軸に沿ってラスター走査されました。続いて、走査ビームは、焦点距離 54 mm (LSM04-BB、Thorlabs, Inc.、ニュージャージー州、米国) および 200 mm (TTL200-B、Thorlabs, Inc.、ニュージャージー州、米国）、それぞれ。この構成により、（コリメータからの）光ビームサイズは 3.7 倍に拡大されました。次に、拡大されたビームは、長方形ビームスプリッター (BSW11、Thorlabs, Inc.、ニュージャージー州、米国) によって 50:50 の比率で分割されました。分割されたビームは、リファレンスアームとサンプルアームのセットアップに向けられました。基準光路に向かうビームは、連続可変減衰器 (NDC-50C-4 M、Thorlabs, Inc.、ニュージャージー州、米国) や 4 × 対物レンズ (UPlanFL N 4.0x、オリンパス、東京、日本）、焦点距離 45 mm、続いて高反射広帯域ミラー（PF10-03-P01P、Thorlabs, Inc.、ニュージャージー州、米国）。同様に、サンプル経路では、入射分割ビームは、基準経路で使用される対物レンズの仕様と一致する対物レンズに向けられました。サンプル表面からの後方反射レーザービームは、ビームスプリッター内で後方反射された参照ビームと干渉しました。後方散乱干渉信号は、サーキュレーターを介して、4096 ピクセルのラインスキャンカメラ (Sprint spl4096-140k、Basler AG、アーレンスブルク、ドイツ) を備えた分光計に送られました。現在の構成では、スペクトルはカメラセンサーの中央部分のみをカバーし、ラインスキャンカメラの 2048 ピクセルのみが使用されました。検出された信号はコンピューター上で処理され、断面および正面の OCM 画像がリアルタイムで表示されます。構築された OCM システムの軸方向および横方向の解像度は約 5 μm、最大 FOV は水平軸、垂直軸、深さ軸に沿ってそれぞれ 4 × 4 × 1 mm でした。 250 個の横位置 (A ライン) のセットを連続してスキャンして 1 つの 2D 断面 OCM 画像を構築し、250 個の水平位置 (2D 画像) をスキャンして 1 つのボリューム画像セットを取得しました。リアルタイムで正面画像を取得するために、ボリューム画像セットから特定の深さが (必要に応じて) 選択されました。 OCM システムの平均速度は 90 フレーム/秒でした。

マルチモーダルイメージングシステムの概略図。 MPM および OCM 光源、検出コンポーネント、および 2 軸マイクロメーター並進サンプルステージとともに使用される光学コンポーネントを含む光学設計の概略図。図は一定の縮尺で描かれていません。

MPM システムには、最大出力 180 mW、パルス幅 < 70 fs (通常 45 fs) の高出力フェムト秒ファイバーレーザー源 (ELMO HP、Menlo Systems, Inc.、ニュージャージー州、米国) が搭載されていました。 100MHzの繰り返し速度。レーザー源の中心は 1560 nm で、スペクトル帯域幅は 30 nm でした。レーザービームは、光トリプレットコリメータ (TC18APC-1550、Thorlabs, Inc.、ニュージャージー州、米国) を使用して、約 ~ 3 mm のビームサイズでコリメートされました。レーザー出力は、光減衰器の組み合わせを使用して必要に応じて制御されました。次に、伝播ビームは電子制御された機械シャッター (SHB025、Thorlabs, Inc.、ニュージャージー州、米国) を通過しました。コンピュータは、必要に応じて特定の動作時間中にサンプル領域に光学的照明を得るために機械的シャッターを制御した。シャッター後のレーザービームは、二軸検流計走査ミラー (GVSM002-JP、Thorlabs, Inc.、ニュージャージー州、米国) を使用して水平軸と垂直軸に沿ってラスター走査されました。次に、レーザービームは、焦点距離 50 mm と 200 mm のスキャンレンズ (SL50-2P2、Thorlabs, Inc.、ニュージャージー州、米国) とチューブレンズ (TTL200MP、Thorlabs, Inc.、ニュージャージー州、米国) の組み合わせを通過しました。、それぞれ。この光学的組み合わせにより、レーザービームは 4 倍に拡大されました。コリメートされ拡大されたレーザービームは、ダイクロイックミラー (FF801-Di02-25 × 36、IDEX Health & Science, LLC、ニューヨーク、米国) を通って伝播しました。ダイクロイックミラーは入射レーザー光に対して４５°の傾斜角で設置した。次に、焦点距離 6.2 mm の 30 × 非球面対物レンズ (5723-CH 30x、Newport Corporation、CA、USA) を使用して、方向を変えられた MPM レーザービームをサンプルに焦点を合わせました。サンプル上に集束された MPM レーザービームは、サンプルの分子から SHG 信号を生成し、その信号は後方散乱され、対物レンズによって収集されます。次に、後方散乱した SHG 信号は、焦点距離 200 mm、バンドパスフィルター (FF01-794/32-25、 IDEX Health & Science, LLC、ニューヨーク、米国）、および焦点距離 50 mm の色消しダブレットレンズ（AC254-050-B、Thorlabs, Inc.、ニュージャージー州、米国）。このビームは光電子増倍管 (H7422-50、浜松ホトニクス、静岡県) に送信されました。電気的に変換された信号は前もって増幅され、その後コンピュータに送信されてさらなる処理が行われ、サンプルの正面 MPM SHG 画像が取得されました。 MPM システムの分解能は約 1 μm でした。記載された光学構成により、最大 FOV 300 × 300 µm が達成されました。

OCM および MPM イメージングシステムは、それぞれ上方向と下方向から顕微鏡 (OLYMPUS-IX73、オリンパス、東京、日本) に取り付けられ、OCM および MPM レーザービームは同軸に整列されました。高解像度 MPM の ROI の x 座標と y 座標は、リアルタイムの正面 OCM 画像から選択されました。相関した断面 OCM 画像から ROI の深さ座標を選択しました。これは、光熱応答を観察するための深さ位置でした。 MPM の選択された ROI の横方向のターゲティングは、微細位置決め (X および Y) ステージ (MCL-MOTNZ、Mad City Labs Inc.、ウィスコンシン州、米国) の並進運動によって実行されました。次に、顕微鏡本体の内蔵軸方向の動きに対して MPM の焦点位置を変更しながら光熱応答の変化を観察することにより、MPM 励起光を ROI の深さ位置に焦点を合わせました。サンプルの並進移動は LabVIEW プログラムを使用して自動化されましたが、軸方向の移動は手動で制御されました。

提案されたマルチモーダル PD-PT OCM ガイド MPM イメージングシステムの方法論と堅牢性を評価および分析するために、2 つのファントムサンプルが製造されました。サンプルの 1 つは、図 7a に示すように、市販の超音波ゲルを 1 mm スライドガラス上に配置することによって準備され、厚さ 170 ± 5 μm のカバースリップが超音波ゲル上に積み重ねられました。ここでは、熱特性がより安定しており、熱伝導率が生体組織に近い超音波ゲルが使用されています61。作製したサンプルの全体の厚さは約 1500 μm、導入された超音波ゲルの厚さは約 330 μm でした。同様に、図7bに示すように、生物組織の複雑なネットワーク構造を模倣するために、多層の複雑なネットワークファントムサンプルを開発しました。超音波ゲルの代わりに、全体の厚さが約 300 μm の多層レンズ組織と蒸留水を使用し、サンプルの総厚さは約 1470 μm でした。急速硬化エポキシを使用して、両方のサンプルのカバースリップの周囲の領域をシールし、水の蒸発を防ぎました。図7a、bに示すように、サンプルはMPM対物レンズに向けてカバースリップを取り付け、ガラススライドはOCMに向けて取り付けました。 MPM イメージング用の大量の生物学的サンプルにおける ROI への PD-PT OCM ガイダンスの有用性を実証するために、生物学的標本 (Ixodes dammini (Deer Tick) Female、wm Microscope Slide、Carolina Biological Supply、NC、USA) をサンプルに埋め込みます。顕微鏡スライドは長さと幅が 3 mm (脚の一部を除く) のものを使用しました。ファントムサンプルと生体標本の PD-PT OCM 光熱応答を取得するために、MPM 対物レンズの初期焦点位置はカバーガラスの下 30 μm に配置され、MPM 対物レンズは 10 μm ステップ間隔でサンプルに向かって軸方向に移動しました。、図７ｃに示すように。 MPM 対物レンズが移動するたびに、PD-PT OCM 信号の取得ごとに機械式シャッターが希望の期間 (特に明記されていない限り 350 ミリ秒) 開くように設定されました。光熱応答が測定される OCM の観測点は、適切な光熱信号を提供する ROI 内の点から選択されました。基本的に、ここで指定されるステップ間隔は、厳密に従う必要がある絶対値ではありません。たとえば、図 5 に示す生物学的標本 (メスの Ixodes dammini) の光熱応答を生成するには、20 μm のステップ間隔が使用されました。ステップ間隔と合計読み取り値は、サンプルの組成と厚さに基づいて適応的に選択できます。

ファントムサンプルと PD-PT OCM 実験プロトコルの概略図。 (a)は、超音波ゲルで作製した単純なファントムサンプルの概略断面図です。（ｂ）は、多層レンズ組織で作製された複雑なネットワークファントムサンプルの概略断面図である。 c は、PD-PT OCM ベースの方法論に対する MPM の目標の位置付けを比喩的に表したものです。図は一定の縮尺で描かれていません。

原稿に示されている結果と結論を分析および再現するために必要なすべてのデータは、原稿の関連セクションに提供されています。この研究に関連する追加の詳細およびデータは、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。

Dombeck, DA、Khabbaz, AN、Collman, F.、Adelman, TL & Tank, DW 覚醒している移動マウスにおける細胞分解能による大規模な神経活動のイメージング。ニューロン 56、43–57 (2007)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhang、H.ら。 In vivo での高輝度 AIE プローブを使用した非ヒト霊長類の皮質微小血管系の深度 3 光子蛍光顕微鏡イメージング。バイオマテリアル 289、121809 (2022)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Sofroniew, NJ、Flickinger, D.、King, J. & Svoboda, K. in vivo イメージング用の細胞以下の解像度を備えた広視野の 2 光子メソスコープ。 Elife 5、1–20 (2016)。

記事 Google Scholar

Sacconi, L.、Dombeck, DA & Webb, WW 第二高調波発生顕微鏡における光損傷の克服: 神経活動電位のリアルタイム光学記録。手順国立アカド。科学。 USA 103、3124–3129 (2006)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ルコック、J.、オルロバ、N.、グルーヴェ、BF Wide。速い。 Deep: 生体内ニューロン活動の多光子顕微鏡法における最近の進歩。 J. Neurosci. 39、9042–9052 (2019)。

リン、H.ら。多光子顕微鏡法の最近の進歩は、疾患の進展および肝がんへの臨床応用の分野におけるナノマテリアルと組み合わされています。ナノスケール 11、19619–19635 (2019)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Balu、M.ら。基底細胞癌の in vivo 多光子顕微鏡検査。 JAMAダーマトール。 151、1068–1074 (2015)。

論文 PubMed PubMed Central Google Scholar

カークパトリック、N. et al. ビデオレート共鳴走査型多光子顕微鏡法: 腫瘍微小環境の生体内イメージングのための新しい技術。イントラバイタル 1、60–68 (2012)。

記事 Google Scholar

Provenzano, PP、Eliceiri, KW & Keely, PJ 転移と腫瘍微小環境をモニタリングするための多光子顕微鏡法と蛍光寿命画像顕微鏡法 (FLIM)。クリン。経験値転移 26、357–370 (2009)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

マツダルダ、F.ら。オルガンオンチップモデルは、コネキシンヘミチャネルを介したATP放出が、発達中の蝸牛の大上皮隆起の非感覚細胞における自発的Ca2+シグナル伝達を促進することを示している。研究室チップ 20、3011 ～ 3023 (2020)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Peel, S. & Jackman, M. 微小生理学的システムのイメージング: 総説。午前。Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．細胞生理学。 320、C669–C680 (2021)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Malak, M.、Grantham, J. & Ericson, MB 多光子顕微鏡を使用した in vitro でのカルシウム誘発表皮分化のモニタリング。Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．オプション。 25、1 (2020)。

論文 PubMed Google Scholar

Miller, DR、Jarrett, JW、Hassan, AM & Dunn, AK 多光子蛍光顕微鏡による深部組織イメージング。カー。意見。バイオメッド。工学 4、32–39 (2017)。

論文 PubMed PubMed Central Google Scholar

Leemans, S.、Dvornikov, A.、Gallagher, T. & Gratton, E. AO DIVER: 多光子イメージングの深度限界を前進させるための 3 次元補償光学システムの開発。 APLフォトン。 5、120801 (2020)。

記事 ADS Google Scholar

Sheetz, KE、Hoover, EE、Carriles, R.、Kleinfeld, D. & Squier, JA 多焦点非線形顕微鏡の進歩: 新しいマルチビーム Yb:KGd(WO_4)_2 発振器の開発と応用。オプション。エクスプレス 16、17574 (2008)。

論文 ADS CAS PubMed Google Scholar

Kata, K., Uwamori, H., Ode, T. & Murayama, M. トレードオフの打破: 脳の計算原理を明らかにするための高速、高解像度、広視野の 2 光子顕微鏡の開発。神経科学。解像度 179、3–14 (2022)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

フィールド、JJ 他差動多光子レーザー走査型顕微鏡。 IEEE J. Sel. 上。量子電子。 18、14–28 (2012)。

論文 ADS CAS PubMed Google Scholar

チェン、L.-C. 他。高速光学セクショニングのための時空間集束ベースの広視野多光子顕微鏡。オプション。エクスプレス 20、8939 (2012)。

論文 ADS PubMed Google Scholar

Hoover, EE & Squier, JA 多光子顕微鏡技術の進歩。ナット。光子。 7、93–101 (2013)。

記事 ADS CAS Google Scholar

ボラー、BJ 他メゾスコピック多光子顕微鏡法におけるナイキストを超える高いボクセルレート取得により、フルフィールドのサブミクロン解像度の分解能を実現します。 iScience 24、103041 (2021)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ファスト、A. et al. 人間の皮膚の顕微鏡的な解像度で巨視的イメージングを実現する、高速かつ大面積の多光子外視鏡 (FLAME)。科学。議員 10、1–14 (2020)。

記事 Google Scholar

Galli、R.ら。細胞および組織のラベルフリー多光子顕微鏡検査中の光損傷の固有のインジケーター。 PLoS ONE 9、19–23 (2014)。

記事 Google Scholar

Tauer, U. 生体脳の動的共焦点イメージング生理学における多光子顕微鏡の利点とリスク実験生理学: 多光子顕微鏡は、パルス赤外実験生理学によって放出される 2 つの光子の同時吸収に基づいています。経験値生理。 87(6)、709–714 (2002)。

論文 ADS PubMed Google Scholar

Macias-Romero, C.、Zubkovs, V.、Wang, S. & Roke, S. 広視野の中繰り返し速度の多光子顕微鏡は、生細胞の光損傷を軽減します。バイオメッド。オプション。特急 7 号、1458 (2016)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Stephens、DJ および Allan、VJ 生細胞イメージングのための光学顕微鏡技術。サイエンス (80-. ) 300、82–86 (2003)。

記事 ADS CAS Google Scholar

Rieder, CL & Khodjakov, A. 顕微鏡による有糸分裂: 生きた分裂細胞の内部を見ることの進歩。サイエンス (80-. ) 300, 91–96 (2003)。

記事 ADS CAS Google Scholar

ホーベ、RA et al. 制御された露光顕微鏡法により、蛍光生細胞イメージングにおける光退色と光毒性が軽減されます。ナット。バイオテクノロジー。 25、249–253 (2007)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Ji, N.、Magee, JC & Betzig, E. パッシブパルススプリッターを使用した高速で光損傷の少ない非線形イメージング。ナット。方法 5、197 ～ 202 (2008)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Saggau, P. 高速光学スキャンのための新しい方法と用途。カー。意見。ニューロビオール。 16、543–550 (2006)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Liang、W.ら。光ファイバー二光子内視鏡検査におけるリサージュ走査により、照明の均一性が向上し、光損傷が軽減されます。Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．オプション。 17、021108 (2012)。

論文 ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Reynaud, EG、Kržič, U.、Greger, K. & Stelzer, EHK ライトシートベースの蛍光顕微鏡: より多くの寸法、より多くの光子、より少ない光損傷。 HFSP J. 2、266–275 (2008)。

論文 PubMed PubMed Central Google Scholar

Tang, S.、Krasieva, TB、Chen, Z. & Tromberg, BJ 12 fs 広帯域光源を使用した多光子顕微鏡法と光コヒーレンストモグラフィーの組み合わせ。Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．オプション。 11、020502 (2006)。

論文 ADS PubMed Google Scholar

Tang, S.、Zhou, Y. & Ju, MJ 多光子顕微鏡と光コヒーレンス断層撮影によるマルチモーダル光学イメージング。 J. バイオフォトニクス 5、396–403 (2012)。

論文 PubMed Google Scholar

Graf, BW & Boppart, SA 光コヒーレンスと多光子顕微鏡を統合したマルチモーダル生体内皮膚イメージング。 IEEE J. Sel. 上。量子電子。 18、1280–1286 (2012)。

論文 ADS CAS PubMed Google Scholar

Lai, T.、Chong, SP、Zhou, Y.、Moloney, G. & Tang, S. 多光子顕微鏡と光干渉断層撮影システムを組み合わせた角膜イメージングと屈折率測定。マルチフォト。マイクロスク。バイオメッド。科学。 XIII 8588、85882S (2013)。

記事 Google Scholar

Jeon, D.、Ravichandran, NK、Jung, U.、Jeon, M. & Kim, J. 血流イメージング用のハンドヘルドプローブベースの光ドップラー断層撮影法。赤外線物理学。テクノロジー。 95、183–188 (2018)。

記事 ADS Google Scholar

Kim, J.、Brown, W.、Maher, JR、Levinson, H.、および Wax, A. 機能的光コヒーレンストモグラフィー: 原理と進歩。物理学。医学。バイオル。 60、R211–R237 (2015)。

論文 ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Stifter, D. 生物医学を超えて: 光コヒーレンストモグラフィーの代替アプリケーションと開発のレビュー。応用物理学。 B レーザー Opt. 88、337–357 (2007)。

記事 CAS Google Scholar

Lapierre-Landry, M.、Gordon, AY、Penn, JS & Skala, MC 眼内の内因性および外因性造影剤の生体内光熱光コヒーレンストモグラフィー。科学。議員 7、1–9 (2017)。

記事 CAS Google Scholar

Tucker-Schwartz, JM、Lapierre-Landry, M.、カリフォルニア州パティル、MC Skala, MC 生体内イメージング用のフォトサーマル光ロックイン光コヒーレンストモグラフィー。バイオメッド。オプション。特急 6 号、2268 (2015)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Tucker-Schwartz、JM、Meyer、TA、Patil、CA、Duvall、CL、Skala、MC 金ナノロッド造影剤の生体内光熱光コヒーレンストモグラフィー。バイオメッド。オプション。特急 3 号、2881 (2012)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hu, Y.、Podoleanu, A. & Dobre, G. 透明な媒体および生体組織における金ナノロッドの光熱トラップの調査およびイメージングのための光熱光コヒーレンストモグラフィー。 J. Opt. (英国) 21、095301 (2019)。

ADS CAS Google Scholar

Adler, DC、Huang, S.-W.、Huber, R. & Fujimoto, JG 位相感応光コヒーレンストモグラフィーを使用した金ナノ粒子の光熱検出。オプション。エクスプレス 16、4376 (2008)。

論文 ADS CAS PubMed Google Scholar

Lapierre-Landry, M.、Connor, TB、Carroll, J.、Tao, YK & Skala, MC 生体外の眼におけるインドシアニングリーンの光熱光コヒーレンス断層撮影法。オプション。レット。 43、2470 (2018)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Guan, G.、Reif, R.、Huang, Z. & Wang, RK 位相感応光コヒーレンストモグラフィーを使用した光熱化合物濃度の深さプロファイリング。Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．オプション。 16、126003 (2011)。

論文 ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Dave, DP & Milner, TE 微分位相測定用の光学的低コヒーレンス反射計。オプション。レット。 25、227 (2000)。

論文 ADS PubMed Google Scholar

Telenkov, SA、Dave, DP、Sethuraman, S.、Akkin, T. & Milner, TE 組織内の光熱応答の深さ分解検出のための位相差光コヒーレンスプローブ。物理学。医学。バイオル。 49、111–119 (2004)。

論文 PubMed Google Scholar

タン、P.ら。高い実効分解能を備えた相互相関光熱光コヒーレンストモグラフィー。オプション。レット。 42、4974 (2017)。

論文 ADS PubMed Google Scholar

Makita, S. &Yasuno, Y. 内因性吸収剤の非侵襲的イメージングのための生体内光熱光コヒーレンストモグラフィー。バイオメッド。オプション。急行 6 号、1707 (2015)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lapierre-Landry, M. et al. 光熱光コヒーレンストモグラフィーを使用したゼブラフィッシュ網膜のメラニン分布のイメージング。翻訳。ヴィス。科学。テクノロジー。 7、4 (2018)。

論文 PubMed PubMed Central Google Scholar

Welch、AJ & van Gemert、MJC レーザー照射組織の光熱反応 Vol. 148 (オランダ、シュプリンガー、2011)。

Google Scholar を予約する

Tsang、VTC、Li、X. & Wong、TTW さまざまなセンシング構成を備えた光音響トモグラフィーで使用される内因性および外因性造影剤のレビュー。センサー (スイス) 20、1–20 (2020)。

記事 Google Scholar

ボッケンシュテット、LK et al. マダニが皮膚の下で何をしているか：ライム病スピロヘータの存在下で摂食するマダニの肩甲骨の二光子生体内イメージング。エールＪ．Ｂｉｏｌ．医学。 87、3–13 (2014)。

PubMed PubMed Central Google Scholar

Brassard, JA & Lutolf, MP より優れたオルガノイドを構築するために幹細胞の自己組織化をエンジニアリング。 Cell Stem Cell 24、860–876 (2019)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Brassard, JA、Nikolaev, M.、Hübscher, T.、Hofer, M. & Lutolf, MP オルガノイドバイオプリンティングによるマクロスケールの組織自己組織化の再現。ナット。メーター。 20、22–29 (2021)。

論文 ADS CAS PubMed Google Scholar

ホフ、L.ら。長期にわたるライブイメージングとマルチスケール解析により、上皮オルガノイドの形態形成の不均一性と核となる原理が特定されます。 BMCバイオル。 19、1–22 (2021)。

記事 Google Scholar

Fei, K.、Zhang, J.、Yuan, J.、Xiao, P. オルガノイドイメージング技術の応用と展望を示します。バイオエンジニアリング 9、121 (2022)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Marks, DL、Oldenburg, AL、Reynolds, JJ & Boppart, SA 光コヒーレンストモグラフィーにおける分散補正のためのオートフォーカスアルゴリズム。応用オプション。 42、3038 (2003)。

論文 ADS PubMed Google Scholar

Yeo, T.、Ong, S.、Jayasooriah、Sinniah, R. 組織顕微鏡の自動焦点。画像表示計算します。 11、629–639 (1993)。

記事 Google Scholar

Subbarao, M.、Tyan, J. & Brook, S. オートフォーカスと焦点深度のための最適なフォーカス測定値の選択。 NY 20、864–870 (1998)。

Google スカラー

アガフォンキナ IV ら。広い低温範囲における生体組織ゲルファントムの熱特性。 J.Eng. 物理学。熱理学。 94、790–803 (2021)。

記事 CAS Google Scholar

リファレンスをダウンロードする

この研究は、韓国基礎科学研究院 [助成金番号 D300300 および C330210]、および韓国政府 (MSIT) の資金提供を受けた情報通信技術計画評価研究所 (IITP) [助成金番号 1711152793]。

Center for Scientific Instrumentation, Korea Basic Science Institute, 169-148 Gwahak-ro Yuseong-gu, Daejeon, 34133, Republic of Korea

ナレシュ・クマール・ラヴィチャンドラン、ファン・ハー、キム・ヘミ、サンウォン・ヒョン、ジ・ヨンベ、キム・ドンウク、キム・イジョン、ナム・ギファン、チャン・ギス、イ・ゲソン

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KSL は設計コンセプトを開発し、イメージングシステムを共同開発しました。 RNK はシステムを共同開発し、実験を実施し、データを処理しました。 RNKが原稿草稿を書きました。 KSL と KSC は原稿を批判的に改訂しました。補足情報に使用されているバイオチップのサンプルは、HK が製造しました。著者全員が議論に参加し、原稿の起草と改訂に貢献しました。

Ki Soo Chang または Kye-Sung Lee への通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

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転載と許可

Ravichandran, NK、Hur, H.、Kim, H. 他ラベルフリーの光熱光学コヒーレンス顕微鏡法により、体積測定試料の多光子イメージングで目的の関心領域の位置を特定します。 Sci Rep 13、3625 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-30524-z

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受信日: 2022 年 10 月 27 日

受理日: 2023 年 2 月 24 日

公開日: 2023 年 3 月 3 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-30524-z

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