5Gの効果

Scientific Reports volume 13、記事番号: 8305 (2023) この記事を引用

426 アクセス

7 オルトメトリック

メトリクスの詳細

モバイル通信技術による無線周波数電磁場への曝露による潜在的な健康リスクは、社会的な懸念を引き起こしています。 住民を保護するためのガイドラインが設定されていますが（たとえば、高周波電磁界への曝露下での1℃を超える非特異的加熱）、非熱曝露による潜在的な生物学的影響に関しては疑問が残っています。 第 5 世代 (5G) モバイル通信の出現により、この新しい信号への曝露が細胞ストレス反応を誘発するかどうかを評価することは、安全な展開と健康リスク評価のためのロードマップ上の必須のステップの 1 つです。 BRET (生物発光共鳴エネルギー移動) 技術を使用して、生きたヒト角化細胞および線維芽細胞を最大 4 の比吸収率 (SAR) で 5G 3.5 GHz 信号に連続的または断続的 (5 分間オン/10 分間オフ) に曝露するかどうかを評価しました。 W/kg を 24 時間投与すると、熱ショック因子 (HSF)、RAt 肉腫ウイルス (RAS)、細胞外シグナル制御キナーゼ (ERK) キナーゼ、および前骨髄球性白血病タンパク質 (PML) の基礎活性または化学的に誘発された活性に影響を及ぼします。これらはすべて分子状です。環境細胞ストレス応答に関与する経路。 主な結果は、(i) 線維芽細胞が試験されたより低い SAR (0.25 および 1 W/kg) で曝露された場合、最高 SAR (4 W/kg) では曝露されなかった場合の HSF1 基礎 BRET シグナルの減少、および ( ii) ケラチノサイトではなく線維芽細胞が継続的に 5G RF-EMF 信号に曝露された場合、PML SUMO 化を引き起こす As2O3 の最大効率がわずかに減少します。 それにもかかわらず、影響を受ける細胞の種類、実効SAR、曝露モード、および分子細胞のストレス応答に関してこれらの影響が矛盾していることを考慮すると、私たちの研究では、皮膚細胞が5G RFに曝露されたときに分子影響が発生する可能性があるという決定的な証拠は示されていないと結論付けました。 -EMF 単独、または化学的ストレス要因と併用。

過去数十年にわたるモバイル通信の急速な展開の中で、第 5 世代 (5G) ワイヤレス ネットワークは、使用量の急激な増加、接続デバイスの数、および接続の必要性に関連する問題を解決することにより、4G LTE テクノロジーを改良するように設計されました。信頼性が高く、遅延が少ない1、2。 このような成果を達成するには、2G、3G、4G にすでに展開されている周波数帯域に加えて、新しい周波数帯域が必要でした。 その中で、3.4 ～ 3.8 GHz 帯域はブロードバンドのカバレッジと速度の間で優れたトレードオフを提供しますが、建物内での伝播と浸透が少ないという特徴を持つ 26 GHz 帯域は、高データの限られたエリアをカバーするために第 2 段階で導入される予定です。渋滞。 したがって、現在の 2.6 GHz および 1.8 GHz のモバイル アンテナと同じセル サイトを使用できる 3.5 GHz 帯域 (C バンドとも呼ばれる) が、現在の 5G のコア バンドです。

環境高周波電磁場 (RF-EMF) への曝露による生物学的および健康への影響は、20 世紀後半以来数多くの研究の対象となっており、今でも社会的関心の焦点となっています。 この研究分野は、2011 年 5 月に RF-EMF を 2B 発がん物質として分類するという国際がん研究機関 (IARC) の決定によっても強化されました。

特に、RF 光子のエネルギーは DNA 切断などの生物学的標的の化学修飾を引き起こすほど強力ではありませんが、RF-EMF 曝露下での生体組織の誘電加熱は完全に特徴付けられています。 したがって、関連するリスクから国民を守るためのガイドラインが確立されました3。 しかし、RF-EMF 曝露が「非熱的」影響 (つまり、生体組織の温度上昇によって引き起こされない生物学的影響) を引き起こす可能性があるかどうかは、依然として研究が難しい問題です。 これらの影響については機構的な裏付けがないため、科学界は潜在的な RF-EMF 非熱的影響に関する実証研究のみに頼ることができます 4,5,6。

残念ながら、5G で使用される新しい周波数信号への RF-EMF 曝露によってもたらされる潜在的な生物学的危険性について利用できる科学的研究のデータはほとんどありません。 私たちの知る限り、未変調または GSM 変調された 3.5 GHz RF-EMF が生体物質に及ぼす影響を調査した論文は、4 つの異なるチームによって行われた 6 件のみがすでに発表されていますが、その後 5G に関する生物学的研究は発表されていません。 -変調された 3.5 GHz RF-EMF 信号。 ダスグプタら。 彼らは、発育中のゼブラフィッシュを、等温培養条件下で受精後6〜48時間、8.27 W/kgの比吸収率（SAR）で非変調の3.5 GHz RF-EMFに曝露しました7,8。 これらの著者らは、曝露群で差次的に発現した28個の遺伝子を用いて、微妙だが持続的な感覚運動効果と、受精後48時間の軽度のトランスクリプトーム破壊を測定した。 ガイドラインに準拠した SAR レベルを使用してこれらの影響が依然として測定可能かどうかはまだ判断されていません。 王ら。 らは、3 つの異なる SAR (2.6、26、および 260 mW/kg) で無変調 3.5 GHz RF-EMF を使用して、キイロショウジョウバエに対する短期および長期曝露の影響を評価しました9,10。 これらの著者らは、概日リズム、熱ストレス、酸化ストレス、体液性免疫に関与する遺伝子発現の変化を伴う、昆虫の活動、睡眠、発育に対する中程度ではあるが重大な影響を示した。 ヤンら。 SAR が 0、2、4、または 10 W/kg の無変調 3.5 GHz RF-EMF 曝露がモルモットの不安様行動および聴覚皮質 (ACx) に及ぼす影響を 72 時間評価しました。 この研究は、動物の不安や聴覚閾値の増加はなく、ACx における酸化ストレス、アポトーシス誘導、および超微細構造損傷が SAR に依存して増加することを指摘しました 11。 最後に、Bektas ら。 GSM 変調された 3.5 GHz 信号が、脳内計算 SAR 0.323 W/kg で 1 日 2 時間、30 日間曝露された糖尿病ラットと健康なラットの脳のエネルギー恒常性と酸化還元バランスの変化を誘発するかどうかを評価しました12。 RF-EMF 曝露後、糖尿病ラットと健康なラットの間で、脳組織の総抗酸化物質レベルの減少と、総酸化物質および H2O2 レベルの増加が観察されました。 これらの著者らは、RF-EMFが脳内の食物摂取とエネルギー代謝に影響を与えるホルモンレベルの変動を引き起こし、海馬の変性ニューロンの数を増加させたことも観察した。 まとめると、これらの研究は、真核生物のいくつかのストレス応答経路に対する 3.5 GHz RF-EMF の潜在的な影響を示唆しています。

したがって、新しい RF-EMF 技術が、適切に制御された曝露条件下で細胞ストレス反応を誘発するかどうかを評価することは、5G 信号の健康リスク評価のロードマップ上の必須のステップの 1 つです。 特に、分子レベルでは、熱ショックタンパク質（HSP）の発現とRAS/MAPKシグナル伝達経路が誘導されるかどうかは、細胞のこれらの分子システムのストレス応答が中心的な役割を果たしているため、非常に議論されています13、14。 RF-EMF にさらされた細胞における酸化ストレスの発生に関しても疑問が残っています 15。 したがって、細胞ストレス応答に関与する一般的な分子機構に対する、5G 信号などの新たに展開された RF 信号の影響をさらに評価することが重要です。 本研究では、基礎的および化学的に誘導された熱ショック因子 1 (HSF1)、RAt 肉腫ウイルス (RAS)、および細胞外シグナル制御キナーゼ (ERK) に対する 5G 変調 3.5 GHz RF-EMF 信号の影響を調査しました。キナーゼ、および前骨髄球性白血病 (PML) 活性。

HSF1 は、真核生物における熱ショックタンパク質の転写の「マスター制御因子」です 16。 RAS および ERK キナーゼは、RAS17、18 の活性化後に細胞外シグナルを細胞内プロセスに中継する Ser/Thr マイトジェン活性化プロテインキナーゼ (MAPK) カスケードの重要な要素です。 RAS/MAPK シグナル伝達経路は、遺伝子発現、細胞成長、生存などのさまざまな細胞プロセスの制御において極めて重要です。 最後に、PML タンパク質は、PML 核小体 (PML NB) の形成の要です。 これらは、酸化ストレスなどのさまざまなストレス条件に応答して形成される球状の核ドメインであり、アポトーシス、老化、DNA 修復、エピジェネティックな制御、および発癌の制御にとって最も重要です 19。 したがって、PML NB の形成は細胞ストレス応答のマーカーであり、HSF1 や ERK20、21、22、23、24 を含む多数の転写因子や核タンパク質の活性にとっても重要です。 皮膚細胞はリスク評価で考慮すべき 5G 曝露の主な標的組織となるため、私たちの研究ではヒトの皮膚線維芽細胞とケラチノサイトを細胞モデルとして使用しました25。 これらの細胞は、HSF1、RAS、ERK、 PML 活性は、使い古された生物発光共鳴エネルギー移動 (BRET) ベースの分子プローブのおかげで評価されました 13、14、26。

RAS および ERK BRET センサーは、EKAREV および RaichuEV-ras FRET プローブ 27 の蛍光エネルギードナー (ECFP または Turquoise-GL) と蛍光エネルギーアクセプター (YPet-M) を nanoLuciferase (nLuc28) および mNeonGreen (mNeonG29) に置き換えることによって開発されました。それぞれ。 ERK (pEKAREV) および RAS (pRaichuEV-Ras) をコードする哺乳類発現ベクター FRET プローブは、Dr.matsuda M (京都大学、日本) のご厚意により提供されました。 nLuc および mNeonG をコードする cDNA を最初に合成し (Genescript、Rijswijk、オランダ)、次に pEKAREV および pRaichuEV-Ras 発現ベクター内の NotI と XbaI の間の蛍光エネルギー供与体の代わりにクローン化しました。

nLuc-HSF1 および mNeonG-HSF1 タンパク質をコードする cDNA は、rLuc-HSF1 および sYFP2-HSF1 発現ベクター 13 に由来しており、BamHI と EcoRI の間でウミシイタケルシフェラーゼ II グループと sYFP2 グループがそれぞれ nLuc と mNeonG に置き換えられています。 HSP90 発現ベクターも Poque et al.13 に記載されています。

同様に、nLuc-PMLIII および mNeonG-SUMO1 タンパク質をコードする cDNA は、rLuc-PMLIII および YFP-SUMO1 発現ベクター 26 に由来し、BamHI と EcoRI の間でウミシイタケルシフェラーゼと YFP がそれぞれ nLuc と mNeonG に置き換えられました。

As2O3 (A1010、1 N NaOH に再懸濁した 330 mM 原液) および MG132 (C2211、Z-Leu-Leu-Leu-al、DMSO に再懸濁した 50 mM 原液) は Sigma (リヨン、フランス) から入手しました。 ホルボール-12-ミリステート-13-アセテート (PMA) は Tocris (英国ブリストル) から入手し、セレンテラジン H は Nanolight Technology (米国アリゾナ州パイントップ) から入手しました。

我々は、色素性乾皮症（XP）、相補グループDの19歳女性から樹立されたSV-40不死化皮膚線維芽細胞株、Coriell Institute（ニュージャージー州カムデン）から供給されたXP6BE株30を使用しました。 XP6BE 線維芽細胞は、10% ウシ胎児血清、100 単位 mL-1 ペニシリンおよびストレプトマイシンを添加したダルベッコ改変イーグル培地 - 高グルコース (DMEM) (D6429、Sigma) 中で維持されました。 HaCaT ケラチノサイト 31 は、ウシ下垂体抽出物 (BPE; カタログ番号 13028-014、Gibco、Thermo Fisher Scientific、米国マサチューセッツ州ウォルサム) を添加したケラチノサイト SFM (参照番号 17005-034; Thermo Fisher Scientific、マサチューセッツ州ウォルサム、米国) で維持されました。 & ヒト組換え EGF (カタログ番号 10450-13、Gibco、Thermo Fisher Scientific、Waltham、MA、USA) キット Gibco™ Keratinocyte-SFM Supplement (Ref 37000015、Gibco、Thermo Fisher Scientific、Waltham、MA、USA) に付属しています。 トランスフェクションの24時間前に、6ウェルディッシュにウェルあたり500,000細胞の密度で細胞を播種しました。 前述のように、一過性トランスフェクションは、PEI:DNA 比 4:1 のポリエチレンイミン (PEI、直鎖、分子量 25,000、カタログ番号 23966 Polysciences, Inc.、ペンシルベニア州ウォリントン、米国) を使用して実行されました 32。 HSF1 活性の測定のために、0.1 μg の nLuc-HSF1 発現ベクターを 1.4 μg の mNeonG-HSF1 および 0.5 μg の HSP90 発現ベクターと同時トランスフェクトしました。 RAS および ERK 活性を測定するために、1 μg の pEKAREV または pRaichuEV-Ras BRET 発現ベクターを 1 μg の空のベクターと同時トランスフェクトしました。 PML 活性の測定のために、0.1 μg の nLuc-PMLIII 発現ベクターを 1.9 μg の mNeonG-SUMO1 と同時トランスフェクトしました。 一晩インキュベートした後、トランスフェクトされた細胞を剥がし、赤色フェノールを含まない DMEM (Ref 21063-029、ThermoFisher Scientific、米国マサチューセッツ州ウォルサム) に再懸濁し、96 ウェル白色プレートにウェルあたり 105 細胞の密度で再播種しました。 Tristar2 照度計 (Berthold Technologies、Bad Wildbad、ドイツ) で読み取るため、または直径 12 mm のカバーガラス (Knittel Glass) 上で読み取るために、d-ポリリジン (Sigma、リヨン、フランス) で前処理した透明底 (Greiner Bio one、Courtaboeuf、フランス) 、ブラウンシュヴァイク、ドイツ）SpectraPro 2300i分光計（Acton Optics、アクトン、マサチューセッツ州、米国）で読み取るためにd-ポリリシンで処理しました（下記を参照）。 細胞は、BRET アッセイのために処理される前に 24 時間培養下に放置されました。

細胞を 24 時間偽曝露するか (すなわち、細胞を RF-EMF の非存在下で培養した)、または指定された RF-EMF 曝露条件に 24 時間曝露しました。 偽または RF 曝露の最後の 18 時間、4 時間、または 15 分間、細胞をそれぞれ指定濃度の MG132、As2O3、または PMA とともにインキュベートしました (図 1A)。 各 96 ウェル プレートでは 1 つの化学物質のみがテストされました。 ただし、マルチチャンネルピペットを使用して 37 °C に予熱した 10 倍の原液を注入することにより、同じ化合物のさまざまな濃度を単一プレートで同時にテストしました。 指示されている場合は、溶媒和剤のみを細胞培養培地 (MG132 の場合は DMSO、As2O3 の場合は PMA または水) に注入することによって模擬処理を実行しました。化学処理を実行するために、プレートを残響チャンバーから取り出しました (以下の「細胞」を参照)。材料と方法の「露光、露光セットアップ、および線量測定」のセクションを参照）、すぐに Thermostat Plus マイクロプレート ペルチェ ヒーター (Eppendorf、ハンブルク、ドイツ) にドッキングしてセルを 37 °C に保ちます。 偽露光したプレートも同様に処理しました。 残響チャンバーからプレートを取り出し、マルチチャンネルピペットを使用して細胞培養培地中のさまざまな濃度の化学物質を送り出し、細胞を残響チャンバーに戻す作業には 1 分もかかりませんでした。 残りの RF 曝露の完了後、5 μM セレンテラジン H を細胞培養培地に添加し、37 °C に予熱し、装備された TriStar2 LB942 マイクロプレート リーダー (Berthold Technologies、Bad Wildbad、ドイツ) を使用して BRET シグナルを直ちに取得しました。 mNeonG (Iacceptor) の場合は 515 ± 20 nm、nLuc (Idonor) の場合は 460 ± 20 nm を中心とする発光フィルターを使用します。 あるいは、RF-EMF 曝露下でのリアルタイム BRET 測定の場合、RF-EMF 曝露終了の 10 分前に 5 μM セレンテラジン H を細胞培養培地に添加し、最後の 5 分間完全な BRET スペクトルを遠隔記録しました。 RF-EMF 曝露と RF-EMF の非存在下での次の 5 分間。 完全な BRET スペクトルは、完全な可視スペクトルを記録するための BLAZE:400B 裏面照射型 CCD カメラ システム カメラを備えた IsoPlane SCT-320 画像分光器に接続された光ファイバーを使用して取得されました (Teledyne France-Princeton Instruments、Lisses、フランス)。

(A) RF-EMF 曝露と細胞培養培地への化学薬品の添加のタイムライン。 RF-EMF (または偽の RF 曝露) は、薬剤の種類に関係なく 24 時間適用され、指定された期間注射されます。 (B、C) 4W/kg の連続 (B) または断続的 (C) 5G 変調 3.5 GHz RF-EMF 信号にさらされたプレートの温度変化。 インキュベーター内の温度は、細胞への曝露が確実に 37 °C になるように、また曝露期間の開始時の RF EMF による温度上昇を補償するように設定されました。 薬物注入により、細胞培養温度は 0.5 °C 未満の一時的な低下が引き起こされます (B)。

BRET シグナルは、式 1 に従って、アクセプター ウィンドウ (ImNeonG) で測定された発光強度とドナー ウィンドウ (InLuc) で測定された発光強度の比を計算することによって決定されました。 (1)

nLuc と mNeonG の発光スペクトルが重複しているため、mNeonG フィルターで検出される光の一部はルシフェラーゼ発光に由来し、その結果、信号が汚染されます 33。 したがって、その構成では、正味の BRET は、同じ実験で nLuc および mNeonG コンストラクトを共発現する細胞の BRET 比から nLuc コンストラクトのみを発現する細胞の BRET 比を引いたものとして定義されました。

GraphPad Prism v8.00 for Mac ソフトウェア (GraphPad Software、米国カリフォルニア州ラホーヤ) を使用して、用量反応曲線をプロットし、統計分析を実行しました。 エラーバーのサイズは、データセット内の SD を示します。 S 字状の用量反応曲線は、式 1 を使用してフィッティングされました。 (2):

ここで、X はアゴニスト濃度の対数、Y は応答です。 一番下は、一番下のプラトーでの Y 値であり、さまざまなプローブの活性化の基礎レベルの尺度として取得されます。 上部は上部プラトーの Y 値であり、上部と下部は各 BRET プローブに対する特定の化学処理の最大有効性の尺度として取得されます。 Log EC50 は、応答が Bottom と Top の中間にあるときの X 値です (補足図 1)。 したがって、EC50 値は、さまざまな化合物が同族の BRET プローブの活性化を引き起こす見かけの効力の尺度を表します (補足図 1)。 さまざまなプローブを活性化または阻害する化学物質の効力は、pEC50 ± SEM (平均の標準誤差)、つまり -log EC50 に等しいとして表されます。

1 サンプルのウィルコクソン符号付き順位検定を使用して、基礎 BRET、化学物質の効力および有効性について、偽 (RF EMF 条件なし) と RF-EMF 曝露条件の間の各独立した実験で計算された差異の帰無仮説に対する統計的有意性を評価しました。 （以下、それぞれΔBasal BRET、ΔpEC50、ΔMax効力と呼ぶ）。 各実験条件に対して実行された独立した実験の総数 (n) が表示されます。 各 RF-EMF 曝露条件に対して 1 回の疑似曝露を実行しました。 0.05 未満の P 値は統計的に有意であるとみなされました。

細胞を、96 ウェル組織培養プレート (TCP) 内で 0.25、1、および 4 W/kg の SAR レベルで 24 時間曝露しました。 実際の現実の曝露を模倣し、潜在的な非熱的生体影響の検出に役立てるため、連続波 (CW) モードと同じ平均 SAR レベルで断続曝露 (5 分間オン/10 分間オフ) が実装されました。 RF EMF 偽曝露も同様の実験条件下で、ただし発電機をオフにして、つまり 0 W/kg に等しい SAR で実行しました。 最近設計され、特性が評価された新しい曝露システムが、5G 変調 3.5 GHz 信号への細胞曝露に初めて使用されました 34。 このシステムは、37 °C、5% CO2 という望ましい生物学的条件を維持できる細胞培養インキュベーターに基づいています。 実験的測定と数値シミュレーションによるシステムの包括的な特性評価については、別の場所で詳しく説明されています 34。 簡単に説明すると、ステンレス鋼の壁で作られた 150 リットルのインキュベーター (BINDER Gmbh、ドイツ、タリンゲン) を残響室、つまり統計的に均一な、高い Q 値を備えた金属製の大きな密閉空洞として使用しました。ランダムに分極され、等方的な場の分布は、場の成分を機械的に撹拌することによって達成されました35。 3.5 GHz の電磁信号が、印刷されたパッチ アンテナを通じて生体サンプルに配信されました。 5 レベルのプラスチック ホルダーを使用して、6 ウェルまたは 96 ウェルの 10 個の TCP (ホルダー レベルごとに 2 個) を収容し、同時に露出させました。 6 ウェル TCP および 96 ウェル TCP の各ウェルには、それぞれ 2 ml および 200 μl の細胞培養培地を充填しました。 曝露中の実験の再現性を確保するために、チャンバー負荷に対する SAR の依存性が高いため、インキュベーターには電磁特性評価に使用したのと同じ構成、つまり 6 ウェル TCP と 96 ウェル TCP をそれぞれ 4 つと 6 つ搭載しました。

信号生成ユニットは、RF 信号発生器 (SMBV100A、Rohde & Schwarz、ミュンヘン、ドイツ)、45 dB ゲイン アンプ (Mini-circuits、ZHL-16W-43 + 、ニューヨーク、米国)、電源サーキュレータ ( Pasternack、PE83CR1005、カリフォルニア州、米国）、および双方向カプラー（Mini-circuits、ZGBDC30-372HP + 、ニューヨーク州、米国）をインキュベーターの外に配置しました。 さらに、チャンバーへの所望の入力電力を継続的に監視するために、双方向カプラーに接続された電力計 (Agilent N1912A、米国) を使用して入射電力と反射電力を監視しました。

局所 SAR は、光ファイバー プローブ (Luxtron One、Lumasense Technologies、カリフォルニア州、米国) で記録された RF-EMF 誘発加熱の温度測定を通じて実験的に取得されました。 96 ウェル TCP で測定された SAR は、アンテナ入力電力 1 ワットあたり約 1 W/kg でした。 私たちのシステムを検証するために、有限差分時間領域 (FDTD) ベースの電磁手法を使用して数値シミュレーションが実行されました 36。 シミュレーションの結果は、完全な回転に相当するスターラーの 50 の位置にわたって平均化されました。 数値シミュレーションでは、露出したウェルの特定の位置にホットスポットが存在しないことは保証されませんが、金属製スターラーの機械的回転によるフィールド成分の継続的な撹拌により、変動が 30% 以内の良好な SAR 均一性の達成が保証されました。 全体として、ICNIRP ガイドラインに準拠した標準偏差を考慮すると、実験的 SAR と数値的 SAR は 30% 未満の差でよく一致していることが示されました 3。 1 W に正規化された測定値とシミュレーション値に従って、生物学的曝露中の入射電力は、96 ウェル組織培養プレートで 0.25、1、および 4 W/kg の必要な曝露レベルが得られるように調整されました。 研究の特定の細胞曝露条件下で、Luxtron プローブ (Lumasense) を使用して、曝露された媒体の誘発温度上昇の測定も実行され、4 W/kg で 1.7 °C、1 W で 0.7 °C の温度上昇が示されました。 /kg であり、連続 RF 曝露を使用した場合、0.25W/kg で温度上昇は 0.1 °C 未満で無視でき、温度上昇は 4 W/kg で 0.8 °C、1 W/kg で 0.3 °C、0.1 °C 未満です。断続的 (5 分間オン、10 分間オフ) RF 曝露を使用して、0.25 W/kg で。 生体サンプルを 37 °C に維持するために、インキュベーターの温度もそれに応じて下げました。 さまざまな SAR レベルでの RF セッション全体の間の培養ウェルの底での細胞培養の温度安定性を、別個のプレートのセットで慎重に評価しました (連続下で 4 W/kg で得られた典型的な温度トレースについては、図 1B、C を参照してください)それぞれ、断続的な暴露条件）。 予想どおり、断続的な信号にさらされた細胞培養物の温度はわずかに波打っています (図 1C)。 注目すべきことに、図 1B に例示されているように、化学物質の注入により、細胞培養温度が 0.5 °C 未満だけ一時的に低下しました。

5G 変調された 3.5 GHz RF-EMF が HSF1、RAS、ERK、または PML の基礎活性または化学的に誘導された活性に影響を与える可能性があるという仮説は、私たちのチームによって以前に説明された BRET ベースのアッセイを使用してテストされました 13、14、26。 BRET は、リアルタイムの生細胞におけるタンパク質間相互作用およびタンパク質の構造変化を研究するための細胞ベースのアッセイです。 この技術は、生物発光ドナーから蛍光アクセプターへのフェルスター共鳴エネルギー移動に依存しており、両方とも目的のタンパク質に融合しています。 私たちの実験デザインでは、BRET プローブは生細胞で発現されました。 この研究で使用した線維芽細胞およびケラチノサイト細胞株は、以前の研究で使用した HEK293T 細胞よりもトランスフェクションが難しいため、BRET アッセイの rLuc2 タンパク質をより明るいナノルシフェラーゼ (nLuc) に体系的に置き換えました28。 また、nLuc 発光スペクトルと mNeonG 励起スペクトルの重複が大きい​​ため、すべてのアッセイで蛍光アクセプター sYFP2 を mNeonGreen (mNeonG) に置き換えました 37。

HSF1 活性をモニタリングするために、我々は以前、熱ストレス、酸化ストレス、タンパク質毒性ストレスなどのストレス条件に応答した HSF1 活性化のロードマップ上の重要なイベントである HSF1 三量体化 13 の追跡を可能にする分子間 BRET 検査を設計しました 38。 このアッセイでは、N 末端に nLuc タグを付けた HSF1 を、所定の細胞株内で mNeonG タグを付けた HSF1 と共発現させます。 HSF1 が活性化すると三量体化することを考えると、三量体化によりドナー基とアクセプター基が近接するため、結果として生じる BRET シグナルは HSF1 活性化後に増加します 13 (図 2A)。

XP6BE 線維芽細胞における HSF1 活性化に対する連続的または断続的な 5G 信号曝露の影響。 (A) 分子間 HSF1 BRET アッセイの作用機序。 (B) nLuc-HSF1/mNeonG-HSF1 BRET シグナルにおける MG132 誘発変化の用量反応曲線。 nLuc-HSF1 タンパク質と mNeonG-HSF1 タンパク質を一時的に共発現する XP6BE 線維芽細胞を、BRET 測定前に MG132 の濃度を増加させながら 37 °C で 18 時間活性化しました。 結果は、2 回行った 10 回の独立した実験の平均 ± SEM を表します。 MG132 の pEC50 は 6.83 ± 0.25 でしたが、MG132 の最大有効性は 0.106 ± 0.018 でした。 (C–E) nLuc-HSF1/mNeonG-HSF1 BRET プローブでトランスフェクトされた XP6BE 皮膚線維芽細胞を、擬似曝露または 5G 変調 3.5 GHz に 0.25、1、または 4 W/kg で 24 時間連続的または断続的に曝露しました (5分オン/10分オフ）。 BRET測定を行う前に、RF-EMF曝露期間​​の最後の18時間、偽またはRF-EMF曝露下でMG132の濃度を増加させて細胞を活性化した。 パネル CE の結果は、5G RF-EMF 曝露 (Expo) と 5G RF-EMF 曝露 (Expo) との間の基礎 BRET 変動 (C)、MG132 効力変動 (D)、および MG132 最大効力変動 (E) の箱ひげ図を表します。連続および断続 (オン/オフ) 露出モードの両方での偽条件。 帰無仮説からの導出の統計的有意性 (偽と RF-EMF 曝露の間に差異なし) は、1 サンプルのウィルコクソン符号付き順位検定を使用して評価されました。 実験条件に応じて、n = 6 ～ 12。 ns は重要ではありません。 *p < 0.05; **p < 0.01。

皮膚線維芽細胞におけるこのアッセイの機能を評価するために、XP6BE 線維芽細胞株で nLuc-HSF1 を mNeonG-HSF1 と共発現させ 39、プロテアソーム阻害剤 MG132 の濃度を増加させてトランスフェクトした細胞を攻撃して、タンパク質毒性ストレスを引き起こしました 40。 予想どおり、MG132 は、100 ナノモル範囲の EC50 で基礎 BRET シグナルの濃度依存的な増加を誘導し (図 2B)、アッセイの有効性を示しました。

次に、等温条件下で 0.25、1、および 4 W/kg の 5G 変調 3.5 GHz RF-EMF 信号に 24 時間連続または断続的 (5 分間オン/10 分間オフ) 細胞を曝露することが nLuc-HSF1/ に影響を与えるかどうかを評価しました。 mNeonG-HSF1 基礎 BRET シグナル、またはトランスフェクトされた XP6BE 線維芽細胞株における HSF1 を活性化する MG132 の効力または有効性。 興味深いことに、XP6BE 線維芽細胞株を 0.25 W/kg で 24 時間連続曝露した場合、または 0.25 W/kg および 1 W/kg で 24 時間断続的に曝露した場合、HSF1 基礎 BRET のわずかではあるが有意かつ再現性のある減少が測定されました (図 2C)。 。 この BRET シグナルの減少は、測定された基礎 BRET の約 6 ～ 10% にすぎませんが、MG132 によって引き起こされる効果の約 37 ～ 61% (絶対値で) に比例して対応します (表 1 および 2)。 信号が連続的に発せられたか、断続的に発せられたかにかかわらず、4 W/kg では影響は測定されませんでした。 また、RF-EMF信号への曝露は、SARおよび信号の連続または断続的な放射モードに関係なく、MG132の効力もHSF1を活性化するその有効性も変化しませんでした（図2D、E、表3および4）。

基礎的または化学的に誘発された RAS 活性に対する 5G 変調 3.5 GHz RF-EMF 曝露の潜在的な影響を評価するために、H-Ras と Raf の Ras 結合ドメインを挟むことからなる BRET プローブを XP6BE 線維芽細胞にトランスフェクトしました ( Raf RBD)、nLuc と mNeonGreen の間。 この分子 BRET プローブは、松田研究室によって記載された蛍光共鳴エネルギー移動 (FRET) プローブに由来し 27,41 、GTP-Ras が Raf RBD に結合した後の nLuc と mNeonG の接近に依存しています (図 3A)。

XP6BE 皮膚線維芽細胞における RAS 活性化に対する連続的または断続的な 5G RF-EMF 曝露の影響。 (A) RAS BRET バイオセンサーの作用機序。 (B) pRaichuEV-Ras BRET プローブを使用した、PMA による RAS 活性変化の用量反応曲線。 XP6BE 線維芽細胞は、BRET 測定前に PMA の濃度を増加させながら 37 °C で 15 分間活性化されました。 結果は、2 回行った 10 回の独立した実験の平均 ± SEM を表します。 PMA の pEC50 は 7.60 ± 0.17 でしたが、PMA の最大有効性は 0.107 ± 0.012 でした。 (C–E) pRaichuEV-Ras BRET プローブでトランスフェクトされた XP6BE 線維芽細胞細胞を、擬似曝露または 5G 変調 3.5 GHz に 0.25、1、または 4 W/kg で 24 時間、連続的または断続的に曝露しました (5 分間 ON/ 10分オフ）。 BRET測定を行う前の最後の15分間、偽またはRF-EMF曝露下でPMAの濃度を増加させて細胞を活性化しました。 パネル CE の結果は、5G RF-EMF 曝露 (Expo) と 5G RF-EMF 曝露 (Expo) との間の基礎 BRET 変動 (C)、PMA 効力変動 (D)、および PMA 最大効力変動 (E) の箱ひげ図を表します。連続または断続露出モードの両方での偽条件。 帰無仮説からの導出の統計的有意性 (偽と RF-EMF 曝露の間に差異なし) は、1 サンプルのウィルコクソン符号付き順位検定を使用して評価されました。 実験条件に応じて、n = 6 ～ 12。 ns は重要ではありません。 *p < 0.05; **p < 0.01。

同様に、基底または化学的に誘導されたERK活性に対する5G変調3.5 GHz RF-EMF信号曝露の潜在的な影響を、柔軟な構造で接続されたERKセンサードメインとERKリガンドドメインを含むBRETプローブでトランスフェクトされたXP6BE線維芽細胞で評価しました。リンカーですが、最初に説明したような 2 つの蛍光エネルギーアクセプターとドナーの代わりに、mNeonG と nLuc で挟まれています 27 (図 4A)。 内在性 ERK タンパク質は、活性化されると、この BRET プローブのセンサー部分をリン酸化します。 これにより、センサードメインとリガンドドメインの相互作用が引き起こされ、それによってバイオセンサー自体の閉鎖が誘導されます。 このような構造変化により、nLuc が mNeonGreen に近接し、それによって BRET 効率が向上します。

XP6BE 皮膚線維芽細胞における ERK 活性化に対する連続的または断続的な 5G RF-EMF 曝露の影響。 (A) ERK BRET バイオセンサーの作用機序。 (B) pEKAREV BRET プローブを使用した、PMA 誘発性の ERK 活性変化の用量反応曲線。 XP6BE 線維芽細胞は、BRET 測定前に PMA の濃度を増加させながら 37 °C で 15 分間活性化されました。 結果は、2 回行った 10 回の独立した実験の平均 ± SEM を表します。 PMA の pEC50 は 7.72 ± 0.15 でしたが、PMA の最大有効性は 0.178 ± 0.018 でした。 (C–E) pEKAREV BRET プローブでトランスフェクトした XP6BE 線維芽細胞を、擬似曝露または 5G 変調 3.5 GHz に 0.25、1、または 4 W/kg で 24 時間、連続的または断続的に曝露しました (5 分間 ON/10 分)。オフ）。 BRET測定を行う前の最後の15分間、偽またはRF-EMF曝露下でPMAの濃度を増加させて細胞を活性化しました。 パネル CE の結果は、5G RF-EMF 曝露 (Expo) と 5G RF-EMF 曝露 (Expo) との間の基礎 BRET 変動 (C)、PMA 効力変動 (D)、および PMA 最大効力変動 (E) の箱ひげ図を表します。連続または断続露出モードの両方での偽条件。 帰無仮説からの導出の統計的有意性 (偽と RF-EMF 曝露の間に差異なし) は、1 サンプルのウィルコクソン符号付き順位検定を使用して評価されました。 実験条件に応じて、n = 6 ～ 12。 ns は重要ではありません。 *p < 0.05; **p < 0.01。

したがって、これらの RAS および ERK 感受性 BRET プローブを一時的に発現する XP6BE 線維芽細胞を、ジアシルグリセロールを模倣するよく知られたホルボールエステルであるホルボール-12-ミリスチン酸-13-アセテート（PMA）で 15 分間チャレンジし、RAS および ERK の PKC 依存性活性化を引き起こしました。 ERK42。 予想通り、PMA は、RAS (図 3B) および ERK (図 4B) BRET プローブで測定した BRET の濃度依存的な増加を誘導しました。 さらに、どちらの BRET プローブでも、測定された EC50 は数十ナノモル範囲であり、RAS および ERK 活性化をモニタリングするための BRET ベースのアッセイの感度が高いことが再び実証されました。

RASおよびERKプローブを一時的に発現するXP6BE線維芽細胞を5G変調3.5GHz RF-EMF信号に24時間連続または断続的に曝露しても、RASおよびERKの基礎BRET（図3Cおよび4C、表1および2）にもPMA効力にも影響を与えませんでした（これらのキナーゼを活性化する最大有効性（図３Ｄおよび４Ｄ、表３）または最大有効性（図３Ｅまたは４Ｅ、表４）。 0.25 W/kgのSARで24時間連続曝露したXP6BE線維芽細胞において、ERKを活性化するPMAの効力のわずかな減少のみを測定しました（図4D、表3）。

最後に、SUMO 化として知られるプロセスである PML への SUMO の翻訳後の共有結合が、PML の活性化と PML NB の形成につながる重要なイベントであることを知って、分子間 BRET アッセイ 26 を使用して、5G が連続的か断続的かを評価しました。変調された 3.5 GHz RF-EMF 信号にさらされると、PML 活動に影響を与える可能性があります。 このアッセイでは、mNeonGreen で N 末端にタグ付けされた SUMO1 タンパク質と、nLuc で C 末端にタグ付けされた PMLIII タンパク質の間の BRET シグナルを測定しました (図 5A)。 したがって、PMLIII-nLuc/mNeonG-SUMO1 発現ベクターで一時的にトランスフェクトされた XP6BE 線維芽細胞を、PML SUMO 化を効率的に引き起こす細胞内のよく知られた酸化ストレス誘導物質 43 である三酸化ヒ素 (As2O3) で攻撃しました 26,44。 予想どおり、As2O3 は、XP6BE 線維芽細胞における PMLIII-nLuc と mNeonG-SUMO1 間の BRET シグナルを用量依存的に増加させ、EC50 は数十ナノモル範囲であり (図 5B)、これらの細胞における効率的な PML SUMO 化が示されました。 さらに、SARがどのような検査を行ったとしても、一過性にトランスフェクトされたXP6BE線維芽細胞を5G変調3.5 GHz RF-EMF信号に24時間断続的に曝露した後、基礎PML SUMO化もAs2O3効力やPML SUMO化を誘発する最大有効性も影響を受けませんでした（図5C-E） ）。 しかし、XP6BE線維芽細胞を4 W/kgで24時間連続曝露した場合、基礎PML SUMO化のわずかではあるが生殖的な減少を測定しました（図5C）。 この変動は、PML 基礎 BRET シグナルの 3.5% 未満 (表 1)、および As2O3 最大有効性 (絶対値) の 14.9% (表 2) に相当しました。 また、24 時間の連続曝露では、PML SUMO化を誘発する As2O3 の効力は変化しませんでしたが (図 5D、表 3)、条件と比較した場合、As2O3 の最大有効性はわずかに減少しました (図 5E、表 4)。

XP6BE 皮膚線維芽細胞における PML SUMO 化に対する連続的または断続的な 5G-EMF 曝露の影響。 (A) PML SUMO化を検出するための分子間BRETアッセイの概略図。 (B) PML-nLuc/mNeonGreen-SUMO1 分子間アッセイを使用した、As2O3 誘発 PML SUMO 化の用量反応曲線。 BRET 測定前に、As2O3 の濃度を増加させながら、XP6BE 線維芽細胞を 37 °C で 4 時間活性化しました。 結果は、2 回行った 10 回の独立した実験の平均 ± SEM を表します。 As2O3 の pEC50 は 7.19 ± 0.15 でしたが、PMA の最大有効性は 0.161 ± 0.014 でした。 (C–E) PML-nLuc および mNeonGreen-SUMO1 をコードする哺乳動物発現ベクターを同時トランスフェクトした XP6BE 線維芽細胞を、擬似曝露または 5G 変調 3.5 GHz に 0.25、1、または 4 W/kg で 24 時間、連続的または曝露しました。断続的（5分間オン/10分間オフ）。 BRET 測定を行う前の最後の 4 時間、偽または RF-EMF 曝露下で As2O3 の濃度を増加させて細胞を活性化しました。 パネル CE の結果は、5G RF-EMF 曝露（Expo）と連続または断続露出モードの両方での偽条件。 帰無仮説からの導出の統計的有意性 (偽と RF-EMF 曝露の間に差異なし) は、1 サンプルのウィルコクソン符号付き順位検定を使用して評価されました。 実験条件に応じて、n = 6 ～ 12。 ns は重要ではありません。 *p < 0.05; **p < 0.01。

次に、曝露の終了から BRET 読み取りの完了までの短い時間（5 分未満）の間に消失した可能性のある RF 曝露の潜在的な影響を見逃していないかどうかを評価しました。 この仮説を検証するために、セレンテラジン H を細胞培養ウェルに添加し、4 W/kg で連続放射される 5G 変調 3.5 GHz 信号への細胞曝露終了の 10 分前に生物発光反応を開始しました。 次に、光ファイバーを使用して、24 時間の RF-EMF 暴露期間の最後の 5 分間に BRET 比をリアルタイムで遠隔測定し、次の 5 分間は RF 暴露なしで測定を続けました。 図6に示すように、BRETプローブがどのようなものを考慮しても、化学的活性化の有無にかかわらず、RF曝露の終了後にBRET信号の変化は検出されず、それによって以前に得られた結果が検証されました。

RF-EMF シャットダウン後の BRET 変動のリアルタイム監視。 HSF1 (A)、RAS (B)、ERK (C)、または PML (D) BRET プローブでトランスフェクトされた HEK293T 細胞を、4 W/kg で 5G 変調 3.5 GHz に 24 時間曝露し、モックプローブのいずれかに曝露しました。図 1A に示すタイムラインに従って、1 μM の PMA、10 μM の As2O3 または 10 μM の MG132 で処理または処理されました。 セレンテラジン H を、RF-EMF 曝露終了の 10 分前に細胞培養培地に注入しました。 BRET 信号は、RF-EMF 曝露終了前の最後の 5 分間と RF-EMF 曝露終了後の次の 5 分間に遠隔測定されました。 各 BRET プローブについて、疑似処理細胞および薬剤処理細胞における BRET シグナル進化の動態が示されており、3 ～ 4 回の独立した実験の平均を表しています。

皮膚細胞に対する 5G 信号の潜在的な影響を研究するさらなる取り組みとして、皮膚の上層 (表皮) が主にケラチノサイトで構成されていることを考慮して、HaCaT ケラチノサイト細胞株を使用して新しい一連の実験を実施し、 5G 変調された 3.5 GHz RF-EMF に 24 時間連続してさらされると、HSF1、RAS、ERK、および PML 活動に影響を与える可能性があります。 HSF1、RAS、ERK、および PMLIII をプローブする BRET プローブで一過的にトランスフェクトされた HaCaT 細胞は、それぞれ、偽または連続投与後に、漸増濃度の MG132 (HSF1 の場合)、PMA (RAS および ERK の場合)、および As2O3 (PML の場合) でチャレンジされました。 0.25、1、および 4 W/kg の 3 つの異なる SAR で 5G 変調 3.5 GHz RF-EMF に 24 時間暴露。 用量反応曲線は、各実験条件ごとに作成されました（偽曝露条件から得られた曲線については、補足図 2 を参照）。 したがって、各プローブの基礎 BRET と各化学薬品の効力と最大有効性が計算され、偽暴露条件と RF-EMF 暴露条件の間の各パラメーターの変動が図 7 に報告されました。偽と暴露の間に差は見つかりませんでした。分子標的、SAR、または考慮される測定基準が何であっても。 唯一の例外は、HaCaT 細胞を 1 W/kg で曝露した場合、ERK を活性化する最大 PMA 有効性がわずかに増加したことです。

HaCaT ケラチノサイトにおける HSF1、ERK、RAS、および PML 活性に対する連続的または断続的な 5G RF-EMF 曝露の影響。 HSF1、ERK、RAS、および PML 構築物を一時的に発現する HaCaT ケラチノサイト細胞を、擬似曝露または 5G 変調 3.5 GHz に 0.25、1、または 4 W/kg で 24 時間、連続的または断続的に曝露しました (5 分間オン/10 分間オフ) ）。 最後の 18 時間 (HSF1)、15 分間 (RAS および ERK)、または 4 時間、偽または RF-EMF 曝露下で、MG132 (HSF1)、PMA (RAS および ERK) または As2O3 (PML) のいずれかの濃度を増加させて細胞を活性化しました。 RF-EMF 曝露期間の (PML)。 その後、RF-EMF 曝露を停止し、BRET 信号を直ちに測定しました。 各用量反応曲線について、基礎 BRET シグナル、活性化化学剤の効力および最大有効性が導出され、連続または両方の 5G RF-EMF 曝露条件 (Expo) と偽条件の間の変動の箱ひげ図として報告されました。間欠露光モード。 帰無仮説からの導出の統計的有意性 (偽と RF-EMF 曝露の間に差異なし) は、1 サンプルのウィルコクソン符号付き順位検定を使用して評価されました。 実験条件に応じて、n = 6 ～ 13。 ns は重要ではありません。 *p < 0.05; **p < 0.01。

この研究では、等温条件下で 0.25、1、および 4 W/kg の 5G 変調 3.5 GHz RF-EMF 信号に 24 時間連続または断続的 (5 分間オン / 10 分間オフ) 曝露することがヒトの皮膚線維芽細胞に影響を与えるかどうかを調査しました。分子レベルでのケラチノサイト細胞のストレス応答。 当社は、既存の BRET ベースの分子プローブを使用して、さまざまな分子経路の交差点にある HSF1、RAS/ERK、および PML タンパク質に焦点を当て、熱傷害、酸化ストレスなどの幅広い環境ストレスに対する適切な細胞応答を確保しました。 、タンパク質毒性ストレス38。 私たちは、5G 信号への曝露がこれらの細胞ストレス分子マーカーのそれぞれの基礎活性または化学的に活性化された活性に影響を与えるかどうかを評価しました。

XP6BE線維芽細胞をそれぞれ0.25 W/kgで24時間連続および断続的な5G信号に曝露した場合と、1 W/kgで24時間断続的な5G信号に曝露した場合、HSF1基礎BRETレベルが低下することが判明した。 連続シグナルを使用した場合、または細胞を連続的または断続的に 4 W/kg で曝露した場合、1 W/kg では HSF1 基礎 BRET シグナルの変化は検出されませんでした。

一見すると、RF-EMF による HSF1 基礎 BRET シグナルの減少は、偽実験における HSF1 基礎 BRET シグナルの 6 ～ 11% にすぎないため、比較的小さく見えるかもしれません (図 2B)。 ただし、MG132による化学的活性化は基礎BRETを0.1 BRET単位だけ増加させただけ（つまり、基礎BRETの14％増加）（図2B）であるため、5G RF-EMF曝露の影響は絶対値の観点から重要であると考えられます。 興味深いことに、これらの結果は、非変調 (連続波、CW) または GSM 変調 1.8 GHz 信号に 24 時間暴露した HEK293T セルを使用して以前に得られた結果と一致しています13。 この以前の研究では、RF-EMF 曝露は、試験した低 SAR (1.5 W/kg) では HSF1 基礎活性をわずかに減少させましたが、高 SAR (4 W/kg) では減少させませんでした。 基礎的な HSF1 に対する RF-EMF の影響が、RF-EMF に曝露された生物における生理学的 HSF1 依存性ストレス応答に影響を与えるかどうかは、まだ解明されていません。 この以前の in vitro 研究では、HEK293T 細胞において HSF1 三量体化を引き起こす MG132 の最大有効性が、1.5 W/kg の CW または GSM 信号および 6 W/kg の CW 信号に 24 時間曝露した後に増加することが検出されました 13。 5G RF-EMF曝露後のHSF1活性化を引き起こすMG132の効力または有効性の変動は検出されませんでした（図2）。

皮膚線維芽細胞に対して行われた他の BRET アッセイを考慮すると、0.25 W/kg で ERK を活性化する PMA の効力のわずかな左方向へのシフト (対数の 4 分の 1 未満) と、PML SUMO 化を引き起こす As2O3 の有効性のわずかな減少のみが検出されました。細胞が継続的に曝露された場合のみ。 分子プローブがどのようなものを考慮し、どのような SAR または信号エンベロープを使用したとしても、5G RF-EMF にさらされた線維芽細胞では、その他の RF 誘発効果は検出できませんでした。 最後に、ケラチノサイトに対して行われたアッセイ全体を通じて、1 W/kg では ERK を活性化する PMA の有効性が約 37% 増加しただけが検出されましたが、0.25 または 4 W/kg では検出されませんでした。 重要なのは、4 W/kg で 5G 変調された 3.5 GHz に 24 時間継続的に曝露された線維芽細胞で BRET 信号がリアルタイムで読み取られた場合、RF-EMF 曝露の終了後に BRET 測定値の変化は検出されなかったことです。 -RF-EMF曝露終了後に96ウェルプレートでBRETシグナルを読み取るのに必要な時間による潜在的なバイアスを除去します。

全体として、これらの結果はいくつかのレベルで不可解に見える可能性があります。 使用されているセルの種類を考慮すると、2 つの異なる搬送波 (1.8 GHz と 3.5 GHz) および異なる信号変調 (以前の研究では CW または GSM 変調、本研究では 5G 変調) を使用した RF-EMF 曝露により、 HEK293T 胎児腎細胞 13 および XP6BE 皮膚線維芽細胞では HSF1 基礎活性が一貫して減少しますが (図 2)、HaCaT ケラチノサイトでは減少しません (図 7)。 同様に、ERK を活性化する PMA の最大効果は、(i) HEK293T 細胞が CW または GSM 変調 1.8 GHz 信号に曝露されると減少し、(ii) ケラチノサイトで増加したが、(iii) 5G RF では影響を受けなかったことが検出されました。 EMF にさらされた皮膚線維芽細胞。 最後に、PML SUMO化を引き起こすAs2O3の最大効果は、継続的に曝露されると皮膚線維芽細胞でわずかに減少しましたが、ケラチノサイトでは変化しませんでした。

何人かの著者が、同一の実験条件下で GHz 範囲の RF-EMF 信号に曝露した後に異なる細胞株で誘発されるいくつかの生体分子効果の定性的または定量的な変動をすでに報告しています 45,46,47。 異なる種類の細胞が同じ刺激に対して異なる反応を示すことは十分に予想されていますが、私たちの知る限りでは、低レベルの RF-EMF がなぜ、どのように生物物質に影響を与えるのかをまだ解明していない研究チームはありません。 非熱的メカニズムの欠如に加えて、ここで検出された HSF1、ERK、および PML 活性に対する RF-EMF 誘発効果が古典的な用量反応プロファイルに従わないことも興味深いです。 例えば、ヒト皮膚線維芽細胞におけるRF-EMFによるHSF基礎活性の阻害は、断続的および連続的曝露の両方において、0.25 W/kgでのみ検出でき、4 W/kgでは検出できませんでした。 驚くべきことに、1 W/kg では、細胞を継続的に曝露した場合、HSF1 基礎 BRET に変化はありませんでしたが、細胞を断続的に曝露した場合、HSF1 基礎 BRET はさらに減少しました。 同様に、ケラチノサイトにおけるERKを活性化するPMAの最大効果は、1 W/kgで増加しましたが、0.25 W/kgでも4 W/kgでも増加しませんでした（図5）。 PML SUMO化を引き起こすAs2O3の最大効果のみが、連続曝露下でのSARとともに用量依存的に減少するようであったが、この効果の大きさは小さかった(表4)。

低レベルの RF-EMF 曝露は非熱的生物学的影響を誘発しますが、高レベルの RF-EMF 曝露は誘発しない可能性がありますか? この研究分野の何人かの著者は、いわゆる「ウィンドウ」効果についてすでに報告しています。この効果では、特定の強度での EMF 曝露が、より低いまたはより高い強度への EMF 曝露では検出できなかった特定の生物学的影響が生じます 48,49。 残念ながら、その後、そのようなウィンドウ効果に関するさらなる実験的証明は発表されず、したがって、根底にある分子機構に関する説明は著者によって提供されませんでした。

より最近では、Pooam et al. は、1.8 GHz RF-EMF に曝露された HEK293T 細胞における ROS 産生が中間信号振幅で最大になることを説明するために、ホルメティック用量反応効果を援用しました 50。 ホルミシスは、低毒性の亜量のストレッサーにさらされたときの刺激された生物学的反応と、同じストレッサーの高毒性レベルの有害な影響によって特徴付けられる毒物学的概念です51。 さらに、HSF1 や ERK52、53 の活性化など、一連の細胞保護分子機構とシグナル伝達経路がホルミシス的に反応することが示されています。 したがって、RF-EMF 曝露が単独で、または化学的活性化剤と組み合わせて、HSF1 または ERK 活性に対するホルミシス反応を誘発または拡大する可能性があるかどうかを、より慎重に研究する必要があります。 興味深いことに、ホルミシスは時間に依存するプロセスでもあります54。 注目すべきことに、平均SAR 4.0 W/kgの1.8 GHz RF-EMFへの短時間曝露（1時間）では、マウス胎児線維芽細胞のDNA断片化が誘導されるのに対し、より長時間曝露（36時間）では、時間依存性のホルメティック効果が説明されることが提案されています。 ） DNA 断片化は、偽条件よりも低いレベルまで減少しました 55。 したがって、我々は 1 回の曝露時間 (24 時間) だけをテストしたため、これらの実験を繰り返して、ここで検出された効果の潜在的な時間依存の変動を評価することは興味深いでしょう。

結論として、私たちの BRET 研究では、皮膚細胞が 5G RF-EMF 信号 (3.5 GHz) に 24 時間曝露された場合、遠方界公衆曝露に関する ICNIRP ガイドライン (0.08 GHz) を超えるレベルであっても、分子影響が発生する可能性があるという決定的な証拠は示されていません。 W/kg)。 (i) 使用した分子プローブ、(ii) 使用した細胞の種類、(iii) 活性化化学物質の存在に依存する統計的に有意な変化は、おそらくほとんどの時間および用量よりもわずかに検出されました。依存性、および (iv) SAR、周波数、搬送波の変調などの RF-EMF 曝露の特性。 100 を超える異なる実験パラメーターを使用し、検出された効果の 1 つを除くすべてが 5% の誤差のリスク内にあったことを考えると、統計的には、偽陽性データが含まれることが予想されました。 私たちは、ラベルフリー技術を使用して初代脳細胞培養物および神経芽腫細胞株に対するさまざまな 1.8 GHz 信号の影響を研究したときにも、同様の結論に達しました 56。 したがって、更なる調査に値する可能性のある HSF1 基礎活性に対する RF-EMF の影響とは別に、試験した RF-EMF 単独または化学物質との組み合わせの生理学的影響に関する十分な証拠は見つかりませんでした。

現在の研究中に使用および/または分析されたデータセットは、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。

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賢明なアドバイスと原稿の校正をしていただいた Bernard Veyret に感謝します。

これらの結果につながる研究は、助成金協定EST-19 RF-18（5G-SAMUプロジェクト）に基づいてフランス食品・環境・労働衛生安全庁（ANSES）から、また助成金に基づいてニューアキテーヌ地域評議会から資金提供を受けました。合意 AAPR2020A-2019-8140010 (PHYSTRIG プロジェクト)。

ボルドー大学、CNRS、IMS 研究所、UMR5218、F-33400、タランス、フランス

アレクサンドル ジュショム、ロレンツァ パトリニョーニ、アンヌ カノヴィ、ヤン ロイク シャッペ、フローレンス プルティエ ド ガンヌ、アナベル ユルティエ、アンドレ ガレンヌ、イザベル ラグロワ、ヤン ペルシュランシエ

リモージュ大学、CNRS、XLIM、UMR 7252、F-87000、リモージュ、フランス

ローザ・オルラッキオ、フィリップ・レヴェック、デリア・アルノー＝コルモス

フランス大学研究所 (IUF)、F-75005、パリ、フランス

デリア・アルノー＝コルモス

パリ科学レトレス研究大学、F-75006、パリ、フランス

イザベル・ラグロエ

ボルドー大学、INSERM、BMGIC 研究所、UMR1035、F-33000、ボルドー、フランス

フランソワ・モワザン & ムリエル・カリオ

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YP がこの研究を考案し、設計しました。 PL、RO、および DAC は、露光システム装置を設計し、電磁線量測定を実行しました。 AJ、LP、AC、YLC、FPDG、AH、FM、MC、YP がデータを収集し、まとめました。 AG は結果の統計分析を実行しました。 YP、IL、DAC、PLが原稿を書きました。 共著者全員が最終原稿を読んで承認しました。

ヤン・ペルシュランシエへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

シュプリンガー ネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

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転載と許可

Joushomme、A.、Orlacchio、R.、Patrignoni、L. 他。 生きた線維芽細胞およびケラチノサイト細胞における HSF1、RAS、ERK、および PML の活性化に対する 5G 変調 3.5 GHz 高周波電界曝露の影響。 Sci Rep 13、8305 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-35397-w

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受信日: 2022 年 10 月 27 日

受理日: 2023 年 5 月 17 日

公開日: 2023 年 5 月 23 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-35397-w

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