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Scientific Reports volume 13、記事番号: 263 (2023) この記事を引用

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神経管閉鎖（NTC）は、分子、細胞、生体力学的メカニズムが関与する胚発生の複雑なプロセスです。 遺伝的要因と生化学的シグナル伝達は広く研究されていますが、組織生体力学の役割はツールが不足しているため、ほとんど解明されていないままです。 ここでは、胚が神経形成を経験しているときに神経板組織のタイムラプス機械イメージングを実行できる光学モダリティを開発しました。 この技術は、共焦点ブリルアン顕微鏡とオンステージ保育器を使用した改良型鶏胚の体外培養の組み合わせに基づいています。 この技術により、生きた胚による神経板組織の機械的進化を初めて捉えました。 具体的には、我々は、卵外培養胚のNTC中に神経板の組織係数の継続的な増加を観察しました。これは、卵内培養のデータおよび以前の研究と一致しています。 さらに、組織の弾性率の増加は、組織の肥厚および屈曲と高度に相関していることがわかりました。 私たちは、この非接触かつラベルフリーの技術が、胚発生における生体力学的メカニズムを理解する新たな機会を開くものと予測しています。

神経管閉鎖術（NTC）は、脊椎動物の神経形成の中心的な処置であり、平面状の神経板を持ち上げて融合させて中空の神経管を形成します。 この手順を失敗すると、重度の神経管欠損症が発生する可能性があり、これはヒトの先天性欠損症の中で最も一般的なものの 1 つです1。 NTC を導く遺伝的および分子的プロセスは、何十年にもわたって広範に研究されてきました 2,3,4。 一方で、NTC に関与する可能性のある生体力学的メカニズムは、近年ますます注目を集めています 5,6,7。 細胞および組織レベルでは、神経管の形態形成は、発生した力と胚組織の機械的抵抗との間の相互作用の結果として考えることができます8,9。神経管の閉鎖が成功するには、固有の力が弾性特性に依存する反対側の組織張力を克服します。 そのため、組織の生体力学の変化は閉鎖不全を引き起こし、ひいては神経管の形成異常を引き起こす可能性があります10。 NTC 処置中の力の生成と組織の機械的変化は実験で観察されていますが 10、11、12、堅牢な神経形成を確保するための特定の生体力学的プロセスの定量的な寄与はほとんど不明のままです。 主な理由の 1 つは、胚の発育中に神経板組織の生体力学をその場でリアルタイムにマッピングできるツールが不足していることです。

胚組織の機械的特性を定量化するために多くの重要な技術 13 が開発されており、これらはおおよそ 3 つのカテゴリに分類できます。 (1) 原子間力顕微鏡 (AFM) 14、15 またはマイクロカンチレバー 11、16、17 ベースのくぼみなどの接触ベースの技術見かけのヤング率を nm から µm スケールで測定するためのマイクロピペット吸引、組織張力を µm スケールで測定するため 18、組織の引張試験を ~ mm スケールで測定する 19。 接触ベースの技術は、準静的または低周波条件で組織の粘弾性特性を直接定量化できますが、サンプルに物理的にアクセスする必要があり、測定中にサンプルを変形させるために力を加える必要があります。 神経管組織は 3D で不規則な形状をしており、機械的に相互接続されているため、明確な機械的テストには通常、分離外植片が必要です。 (2) 光学/磁気ピンセット 20、21 および微小液滴 22 を含む、ビーズ/液滴ベースのセンサー。 光/磁気ピンセットは力で駆動される硬質ビーズ (直径約 µm) を使用して局所組織のレオロジー特性を感知し、微小液滴は変形可能な液滴 (直径 4 ～ 80 µm) を使用して組織の応力を定量化します。 これらのセンサーは、注意深くキャリブレーションした後、細胞内または細胞の分解能で機械的特性を定量的に測定できます。 ただし、ビーズまたは液滴を組織に注入する必要があるため、侵襲的でスループットが低くなります。 (3) 組織の切除/解剖。 この方法では、超高速パルスレーザービーム 10 またはブレード 23 を使用して組織の一部を解剖し、緩和応答に基づいて組織の張力を評価します。 これはセットアップが簡単なため、魅力的なテクニックです。 ただし、3D では胚組織が機械的に接続されているため、この方法では主に比較的大規模なスケール (~ 100 μm ～ ~ mm サイズ) での全体的な評価が提供されます。 要約すると、既存の方法は、細胞と組織の機械的特性のさまざまな側面をさまざまな空間的および時間的スケールで定量化でき、胚組織の生体力学の評価を大幅に進歩させました。 しかし、技術的な制限により、生きた胚における NTC 処置中の神経板組織のその場での機械的マッピングは報告されていません。

共焦点ブリルアン顕微鏡法は、生物学的材料の機械的特性を定量化するための新しい技術です24、25、26。 従来の機械的試験方法とは異なり、ブリルアン顕微鏡法ではレーザービームを使用して材料の弾性特性を測定します。 これは、自発ブリルアン光散乱 27 と呼ばれる光学現象に基づいており、入射レーザー光線と材料内に固有の音響フォノンとの相互作用により、散乱光に周波数シフト (つまり、ブリルアン シフト) が導入されます (「方法」を参照)。 。 カスタマイズされた分光計を使用して散乱光のブリルアン シフトを測定することにより、材料の縦弾性係数を直接定量化できます。 ブリルアン顕微鏡は共焦点構成で設計されているため、回折限界の空間分解能を達成できます。 過去数年間で、我々はこの技術を革新し、細胞内分解能と十分な機械的感度で単一細胞 28,29、胚組織 30、神経板 31 の機械的特性を定量化する実現可能性を実証してきました。 完全光学技術であるブリルアン顕微鏡は、非接触、非侵襲、ラベルフリーの方法で生体力学を測定できます。 したがって、これは、胚発生中の神経板組織の弾性特性をその場でマッピングするための有望なツールである可能性があります。

この研究では、ニワトリ胚の NTC のタイムラプス機械イメージングを実行できる光学モダリティを開発しました。 そのために、共焦点ブリルアン顕微鏡と改良型 ex ovo 培養用のオンステージ インキュベーターを統合しました。 ex ovo 培養により、胚が 21 時間にわたって継続的に発育することが保証され、NTC の完全なイベントがカバーされます。 不透明な卵殻内で胚が発育する in ovo 培養と比較して、ex ovo 培養は優れた光学的アクセス性を提供するため、胚の発育中にリアルタイムの明視野イメージングやブリルアンイメージングが可能になります。 次に、ブリルアン顕微鏡を使用して、胚が神経形成を経験するにつれて頭蓋神経板組織の2D機械画像を継続的に取得しました。 このモダリティを使用すると、ex ovo 培養ニワトリ胚の NTC 中に神経板組織の平均ブリルアン シフトの明確な増加が観察されました。これは in ovo 培養システムの結果と一致しています。 重要なのは、背腹軸上の組織係数の増加が、神経板の肥厚および閉鎖角度と強く相関していることを発見したことです。これは、組織力学が神経板の幾何学的変化と同期して、神経管の閉鎖に成功しました。 このタイムラプス機械イメージング モダリティを組み合わせると、胎児の神経形成中の生体力学メカニズムを理解するための新しいデータが得られます。

タイムラプス 2D 機械イメージングは​​、倒立ブリルアン顕微鏡で実行されました (図 1a) (「方法」を参照)。 定義により、ブリルアン シフトは、屈折率 \(n\) や密度 \(\rho\) などの材料特性による縦弾性率と正の相関があります。 生物学的材料の場合、屈折率と密度の比 \(\rho /{n}^{2}\) は、生理学的プロセス中にほぼ一定であることがわかっています 24,32。 したがって、ここではブリルアンシフトを使用して縦弾性率の相対的な変化を解釈しました。 改変されたex ovo培養では、胚を背側を下にしてペトリ皿に置きました（図1b）。 次に、胚の発育を維持するために、皿をステージ上のインキュベーターに置きました (> 21 時間)。 タイムラプス明視野画像は、卵外培養からの胚が卵内培養からの胚と同様の時間率で発育したことを示唆しています（補足図S1-S2）。

セットアップの概略図。 (a) オンステージインキュベーターを備えた共焦点ブリルアン顕微鏡。 QWP 1/4 波長板、PBS 偏光ビームスプリッター、FC ファイバーカプラー。 (b) ex ovo 培養用のキャリアディッシュ。 側面図 (上) と上面図 (下) には、キャリア内の胚を含むすべてのコンポーネントが表示されます。

神経板の組織力学に対する体外培養とレーザー照射の潜在的な影響を排除するために、さまざまなハンバーガー ハミルトン (HH) 段階 (HH 6 ～ HH 12) で卵内培養胚 (N = 46) を収集しました。前後軸に垂直な断面（頭蓋領域に近い）の 2D 機械画像を取得しました。 代表的なブリルアン画像は、後期のHH段階の胚の神経板が初期の段階よりも高いブリルアンシフトを持っていることを示唆しています（図2a〜d）。 次に、収集したすべての胚について、前後軸の同様の位置での神経板領域の平均ブリルアンシフトを定量化しました。 神経板のブリルアンシフトがHH 6からHH 9 +への明確な増加を示し、その後その値がほぼ維持されることを観察しました（図2e）。 後期胚 (つまり、HH 12) の神経板の平均ブリルアン シフトは 6.353 GHz で、これは初期段階の胚 (つまり、HH 6) の神経板より 0.126 GHz 高く、ヤングの 60% までの増加に相当します。細胞から得られる縦弾性率とヤング率の間の経験的関係に従った弾性率28 (「方法」を参照)。

卵内培養胚の結果。 (a – d) 異なる HH 段階の 4 つの胚の頭蓋神経管組織の代表的なブリルアン画像: (a) HH 6、(b) HH 8、(c) HH 11、(d) HH 12。赤い破線は、神経板領域。 （ e ）胚の頭蓋神経板の平均ブリルアンシフトは、発生段階に対する組織弾性率の継続的な増加を明らかにします。 胚の数: 46。各ドットは、1 つの胚の平均ブリルアン シフトを表します。 スケールバーは50μmです。

NTCの全手順中の神経板の機械的進化を捉えるために、卵外培養胚のタイムラプス機械マッピングを実施しました。 胚は14時間以上継続的に培養され（補足図S3）、その間、3番目の体節ペアの後脳/頸部領域（図3a）で神経板断面のタイムラプスブリルアン画像が取得されました。発達中の神経板に沿って（補足図S3）。 結果は、神経板の平均ブリルアンシフトが培養時間とともに継続的に増加することを示しており（図3b）、これはin ovo培養胚の結果と一致しています。 繰り返しの実験（N = 9）は、NTC中の神経板のブリルアンシフトの増加がニワトリ胚の一般的な現象であることを示唆しています（図3d）。 具体的には、神経板のブリルアン シフトは HH 8 ～ HH 9 まで大幅に増加し、その後はわずかな変化が見られました。 ex ovo 培養の終了点 (HH 10) では、神経板の平均ブリルアン シフトは 6.336 GHz であり、これは初期段階 (HH 8-) のブリルアン シフトよりも 0.097 GHz 高く、約 46% の相対的な増加に相当します。ヤング率の観点から。 これは、卵内培養胚の結果と一致しており、卵外培養およびレーザー照射が胚発生中の神経板組織の機械的進化に影響を及ぼさないことが確認された。

ex ovo 培養胚の微速度撮影ブリルアン イメージング。 (a) 代表的な胚の 14 時間の微速度撮影ブリルアン画像。 (b) (a) の胚の神経板組織の平均ブリルアン シフトは、培養時間とともに増加します。 (c) (a) の胚の神経板組織の厚さは、培養時間とともに増加します。 (d) 発生段階に対するブリルアン シフトの増加がすべての胚で観察されます (N = 9)。 (e) 発生段階に比べて組織の肥厚がすべての胚で観察されます。 (f) 平均ブリルアンシフトと神経板組織の厚さの相関。 シンボルはさまざまな胚を表します。 測定数: 39。統計的有意性を定量化するために 2 サンプル t 検定が使用されます。 *p = 0.008; **p = 0.012; ***p = 0.049; ****p = 0.01。 スケールバーは50μmです。

ブリルアン イメージングにおけるコントラスト機構として組織力学を使用すると、NTC 中の神経板の形態学的変化を定量化することもできます。 ここでは、中央ヒンジ点と神経先端の間の距離の中間である2つの部位の平均厚さを測定しました（図3c）。 公開された文献2,33と一致して、HH 8-（〜13μm）からHH9（〜52μm）まで神経板の4倍の肥厚が観察されました（図3e）。 興味深いことに、我々は、NTC 処置中に組織の肥厚と組織弾性率の増加が非常に類似した傾向を示すことを発見しました。 次に、すべての卵外培養胚の厚さに対するブリルアン シフトをプロットしたところ、ブリルアン シフトの増加と組織の肥厚の間に強い相関関係 (\(p<1\times {10}^{-6}\)) が見出されました。 (図3f)。 このデータは、組織の縦弾性率の増加と組織の肥厚が、おそらく NTC 中に時間的に調整されたイベントであることを示唆しています。

NTC は、組織の力と機械的特性によって駆動される組織の形成とパターン形成の複雑な生体力学的プロセスです。 したがって、組織力学と幾何学の関係を理解することが基本的に必要です。 ここで、我々は組織弾性率の増加が神経板の幾何学的変化とどのように調整されるかを経験的に観察しました。 ブリルアン画像によれば、閉鎖角 \(\beta\) をヒンジ点の中央における神経板の左側と右側の交点として定義しました (図 4a)。 定義に基づくと、\(\beta =180^\circ\) と 0° はそれぞれ神経板が平らで完全に閉じていることを表します。 次に、卵外培養胚（HH8 から HH10 までの発生段階）を 10 度の間隔に分配し、複数の胚が存在する間隔の平均値を計算しました。 次に、ブリルアン シフト \({\omega }_{B}\) を閉角 \(\beta\) に対してプロットしました (図 4b)。 データは、近似パラメーター \ を使用した単純な経験曲線 \({\omega }_{B}=A\cdot \mathrm{exp}\left(B\cdot \beta \right)+C\) によって適切に近似できます。 (A=-0.024, B=7.85\times {10}^{-3},\) \(C=6.348\)、およびフィッティング係数 \({R}^{2}=0.67\)。 この正の相関は、組織弾性率の増加がおそらく NTC 処置中の神経板の屈曲と同期していることを示唆しています。 この分析では、HH 8 より前の胚または HH 10 より後の胚は考慮されていないことに注意してください。この段階では、同じ閉鎖角度 (180° または 0°) に対して組織力学が異なる可能性があります。 ブリルアン顕微鏡は共焦点構成であるため、散乱角は神経板の曲がりの影響を受けません。 したがって、観察されたブリルアン シフトの増加に対して、組織の曲げによって導入される潜在的なアーチファクトを除外しました。 組織の弾性率と曲げの増加を調整する根本的な生物学的メカニズムを理解するには、さらなる研究が必要です。

ブリルアン シフトの増加は、卵外培養胚の組織の曲がりと相関しています。 (a) 閉鎖角度の定義。 (b) 閉鎖角は神経板の平均ブリルアンシフトと相関しています。 HH 8 ～ HH 10 の発生段階にある胚からのデータが収集されます。 \(\beta =180^\circ\) と 0° は、それぞれ神経板が平らで完全に閉じていることを表します。 胚は、閉鎖角度に基づいて 10° 間隔ごとに分配されます。 データ ポイントは、同じ間隔内の胚の平均値を表します。 エラーバーは標準偏差を表します。 実線の曲線は経験関数のフィッティング結果です。

ここでは、生きたニワトリ胚のタイムラプス機械マッピングのための光学モダリティを開発しました。 このモダリティは、共焦点ブリルアン顕微鏡と、細胞内分解能と十分な機械的感度を備えた改良型 ex ovo 培養システムの組み合わせに基づいています。 従来の機械的検査技術とは異なり、私たちの方法では集束レーザー光線を使用して組織力学を定量化し、非接触、非侵襲的、ラベルフリーとなっています。 卵外培養とレーザー照射が胚の発育を妨げないことを確認しました。 我々は、胚が神経形成を経験したときにその場で神経板の2D機械画像を取得することにより、この技術の実現可能性を実証しました。 私たちは、神経板組織が NTC 中に組織係数の継続的な増加を経験したことを発見しました。 神経形成中の組織の硬化は、他の種でも以前に報告されています。 たとえば、アホロートル胚の神経上皮の弾性率は、ステージ 13 からステージ 1519 までに 1 倍増加しました。さらに、アフリカツメガエルの初期胚の背側神経組織は、ステージ 11.5 からステージ 2111 までにほぼ 4 倍増加することが観察されています。 、マウス胚に関する予備研究では、ブリルアン顕微鏡法による神経形成中の組織弾性率が 80% も増加することが示唆されています 31,34。 種および/または使用される技術の違いにより、これらのデータは今回の研究と直接比較することはできませんが、ニワトリの胚で観察された同様の傾向は、種を超えたNTC中に組織生体力学が重要な役割を果たす可能性があることを示唆しています。 組織弾性率の増加は、細胞密度の増加および/またはアクトミオシン収縮性の蓄積によって引き起こされる可能性が高く、今後の研究で調査される必要があります。 さらに、組織の弾性率の増加が組織の肥厚や曲がりと強く相関していることも観察されました。

神経形成は、細胞、分子、生体力学的活動が関与する複雑なプロセスです9,36。 遺伝子制御と生化学的シグナル伝達は広く研究されていますが、生体力学的なメカニズムはあまり調査されておらず、微視的な細胞/分子の活動と巨視的な形態形成の間の根底にある関連性はほとんど不明です5。 当社の全光学技術は、無傷の生きた胚内の 2D/3D 組織力学を直接定量化できるため、NTC の処置における生体力学的メカニズムの役割をより深く理解するための新たな機会を開く可能性があります。 例えば、収束伸長 37 、頂端収縮 38 、および運動間核移動 39,40 を含むいくつかの重要な細胞活動が、観察されたブリルアンシフト、肥厚、および屈曲の増加を調整する可能性があります。 ブリルアン顕微鏡の細胞内分解能により、研究者は組織の生体力学の調節におけるこれらの細胞の挙動の役割をさらに調査できるようになります。 一方で、機械的手がかりは、胚発生中の機械的伝達を通じて細胞の挙動と細胞の運命を導くことができます 36,41。 したがって、この技術は生化学的シグナル伝達と生体力学的合図の間の相互作用を理解するのに役立ちます。 さらに、神経管の閉鎖は、生成された力と組織の機械的抵抗の両方によって物理的に引き起こされます10、12、42。 機械的特性のその場での定量化は、力と組織力学の役割を切り離すのに役立ち、生体力学的相互作用のより良い解明を可能にします。 さらに、計算モデリングは、形態形成のメカニズムを理解するための強力なツールです43、44、45。 私たちの技術によって取得された神経板組織の微速度撮影機械画像は、神経形成のシミュレーションのための新しい入力データを提供できます。

神経管欠損症 (NTD) は、ヒトの先天性疾患の中で最も一般的なものの 1 つであり、遺伝的要因と環境的要因の両方によって制御されます 46,47。 組織レベルでは、NTD は、力の発生と胚組織の機械的特性の異常な相互作用による神経管の物理的不全から発生します。 最近の研究では、遺伝子変異によって誘発される NTD が組織生体力学の変化と関連していることが示唆されています 10。 したがって、組織力学を測定するための定量的ツールにより、研究者は、さまざまな NTD が、組織閉鎖の失敗を引き起こす細胞機構の特定の調節不全に起因していると考えられるはずです。これにより、遺伝的要因や環境要因と組織の生体力学との間のギャップを埋め、感染症の予防に役立つ可能性があります。病気。

定義上、ブリルアン法で測定される高周波縦弾性率は、AFM などの従来の方法で測定される低周波または準静的なヤング率とは異なることに注意してください。 しかし、多くの生物材料では、生物活性に応じて 2 つの弾性率が同じ方向に変化することがわかっています 48,49。 したがって、特定の材料を注意深くキャリブレーションすると、ヤング率の観点からブリルアン データを解釈できる可能性があります。 この研究では、密度と屈折率の比 (\(\rho /{n}^{2}\)) が一定であると仮定して、ブリルアン シフトを使用して組織係数の相対的な変化を推定しました。 ブリルアン由来の弾性率を直接定量化するには、ブリルアン顕微鏡法を、密度および/または屈折率を測定できる他の技術と組み合わせることができます50。 画像深度が増加すると、組織の透明度に応じてブリルアン信号の強度が低下します。 ニワトリ胚の場合、当社の機器の最大侵入深さは約 200 µm です。 より長い波長のレーザー光源を使用するか、補償光学に基づく波面補正技術を使用することで、さらなる改善を達成できます51。 図２および図３の神経板の境界で観察された下部ブリルアンシフトは次のとおりである。 2 と 3 はおそらく実験の成果物です。 共焦点構成では、各ピクセルのブリルアン シフトは、集束ビーム スポット (ボクセル) からのすべてのブリルアン信号の平均です。 神経板の境界では、ビームスポットの一部が周囲のブリルアンシフトの低い培地および/または中胚葉で満たされているため、平均化効果により最終的なブリルアンシフトが減少します。 この影響は、データの後処理とともに高 NA 対物レンズを使用することで軽減できます 35。

白色レグホンの受精卵は、コネチカット大学の養鶏場から購入しました。 in ovo 培養では、卵を高湿度下 37 °C で培養しました。 孵卵時間はハンバーガー-ハミルトン (HH) 病期分類に続きます (つまり、HH-4 胚を得るまでの 26 ～ 29 時間の孵卵) 52。 この研究で行われたすべての実験は関連するガイドラインと規制に従っており、実験プロトコルはメリーランド大学のバイオセーフティオフィスによって承認されました。 この研究では生きた脊椎動物は使用されませんでした。

ex ovo 培養プロトコルは Chapman らから派生したものです。 Schmitz et al.53,54 では、ブリルアン顕微鏡に適応するための修正が加えられています。 20 mm マイクロウェルを備えた 35 mm ガラス底ディッシュ (Cellvis、D35-20-0-N) を ex ovo 培養に使用しました。 1インチの金属リング(Thorlabs、SM1RR)を単層パラフィルムで覆い、1cmの楕円形の穴を中央に切り込み、マイクロウェル(ディッシュの内側底部ウェル)上に置きました。 ex ovo 培養を行うために、in ovo 培養の状況を模倣するために、胚盤葉と卵黄膜を張力下に保持する濾紙キャリア法を使用しました。 ＨＨ４付近の前培養胚を卵から採取し、卵から採取した薄いアルブミンを満たした培養皿（培地）に背側を下にして置いた。 次に、連続培養のためにディッシュをオンステージインキュベーター (Warner Instruments、SA-20PLIXR-AL) に置きました。 胚の周囲温度が約 37 °C になるように、オン状態のインキュベーターのヒーター (Warner Instruments、TC-344C) は、ステージの下側からの熱放散を考慮して 39 ± 0.2 °C に設定されました。対物レンズに向かって開きます。

自発的ブリルアン光散乱は、入射光とサンプル内部の固有の音響フォノンとの間の相互作用です。 この相互作用の結果、出射する散乱光に周波数シフト (ブリルアン シフト) が生じます。 ブリルアン シフト \({\omega }_{B}\) は \({\omega }_{B}=2n/\lambda \cdot \sqrt{{M}^{^{\prime}}/) として定義されます\rho }\cdot \mathrm{sin}(\theta /2)\)、\(n\) は材料の屈折率、\(\lambda\) はレーザー波長、\({M}^{ ^{\prime}}\) は機械的特性を定量化する縦弾性率、\(\rho\) は密度、θ は散乱光の集光角です。 ブリルアン顕微鏡では、後方散乱光が収集され、\(\theta =180^\circ\) が得られました。

生物材料の場合、ヤング率 \(E\) とブリルアン由来の縦弾性 \({M}^{^{\prime}}\) の間には経験的な関係が確立されています。 \(\mathrm{log}\left( {M}^{^{\prime}}\right)=a\cdot \mathrm{log}\left(E\right)+b\)、パラメータ \(a\) と \(b\) は材料に依存する24。 \({M}^{^{\prime}}\) とブリルアン シフト \({\omega }_{B}\) の関係を考慮すると、ブリルアン シフトの相対変化はヤング率の相対変化に \ 関連付けられます。 (\Delta E/E=2/a\cdot \Delta {\omega }_{B}/{\omega }_{B}\)。 細胞の場合、AFM に対するキャリブレーションは \(a=0.0671\) を示します。 ここでは、この校正された関係を使用して、ヤング率の相対的な変化を推定しました。

すべての実験には共焦点ブリルアン顕微鏡を使用しました。 機器の詳細については、当社の最近のレポートを参照してください25。 簡単に言うと、出力が約 30 mW のシングルモード 660 nm 連続波レーザーを光源として使用しました。 レーザービームは、倒立顕微鏡 (Olympus、IX81) に取り付けられた対物レンズ (Olympus、40 × /0.6 NA) によってサンプルに焦点を合わせられ、スポット サイズ 0.7 μm × 0.7 μm × 2.6 μm が得られます。 後方散乱ブリルアン信号は同じ対物レンズで収集され、2 段階 VIPA (Light Machinery、15 GHz FSR) ベースの分光計で分析され、ブリルアン スペクトルは EMCCD カメラ (Andor、iXon 897) で露光時間とともに記録されました。 0.05秒。 2D ブリルアン画像は、電動ステージ (ステップ サイズ: 0.5 μm) を使用してサンプルをスキャンすることによって取得されました。 体の前後軸に垂直な断面をブリルアン顕微鏡でマッピングし、神経板領域の平均ブリルアンシフトを使用して組織の機械的特性を表しました。 ブリルアン イメージの唯一のコントラストは、ピクセルのブリルアン シフトの差によるものです。 薄いアルブミン培地のブリルアン シフトは初期胚の神経板のブリルアン シフトに非常に近いため、ブリルアン画像で神経板組織の境界を特定することが困難になります。 この問題を解決するために、各ブリルアン画像を取得する直前に、ブリルアン シフトがはるかに低く、良好なコントラストが得られるリンゲル液 (Thermo Scientific、BR0052G) で満たされた別の培養皿に胚を一時的に移しました。 ブリルアン測定が完了するとすぐに、胚は継続的な発育のために薄いアルブミン培地に戻されました。 明視野画像を取得するために、胚が ex ovo 培養皿にあるときに、低倍率対物レンズ (Olympus、4x/0.1) と CMOS カメラ (Andor Neo) を使用しました。

自家製 LabView (National Instruments、ver.2021) 取得プログラムを使用して、明視野画像とブリルアン スペクトルの両方を取得しました。 分光計の校正のために、既知のブリルアン シフトを持つ材料 (水とメタノール) のブリルアン スペクトルが記録され、自由スペクトル範囲とピクセル対周波数変換比の計算に使用されました。 各ピクセルのブリルアン シフトは、MATLAB (MathWorks、R2021b) を使用してブリルアン スペクトルをローレンツ関数に当てはめることによって取得されました。 2D ブリルアン画像はピクセル ベクトルから再構築されました。 サンプル サイズは、これまでの経験に基づいて、手法の実現可能性を実証するために適度に大きくなるように選択されました。

この研究の結果を裏付けるすべてのデータは、論文およびその補足情報ファイル内で入手できます。

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LabView 取得プログラムの開発を支援してくれた Eric Frank に感謝します。 この研究は、ユーニス ケネディ シュライバー国立小児保健人間開発研究所、国立衛生研究所 (K25HD097288、R01HD095520) および国立科学財団 (DBI1942003) によって支援されています。

フィシェル生物工学部、A. ジェームス クラーク工学部、メリーランド大学、カレッジパーク、メリーランド州、20742、米国

チェチェン・ハンドラー & ジュリアーノ・スカルチェッリ

ウェイン州立大学生物医工学部、デトロイト、ミシガン州、48201、米国

ジャン・ジタオ

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JZ がこのプロジェクトを発案しました。 CH、JZ、GS が研究計画を立案しました。 CHは実験を行った。 著者全員がデータについて議論しました。 JZ と CH は、他のすべての著者からの意見を取り入れて原稿を書きました。

Jitao Zhang への通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

シュプリンガー ネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

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転載と許可

Handler, C.、Scarcelli, G. & Zhang, J. ブリルアン顕微鏡を使用した生きた胚の神経管閉鎖のタイムラプス機械イメージング。 Sci Rep 13、263 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-27456-z

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受信日: 2022 年 10 月 13 日

受理日: 2023 年 1 月 2 日

公開日: 2023 年 1 月 6 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-27456-z

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